Բաժին «գենետիկ ճարտարագիտություն». Գենի առաքում բջիջում ԴՆԹ-ի բջիջ ներմուծելու գործընթացը

Ներածություն

1 Գենետիկորեն մշակված ֆերմենտների հիմնական խմբերը

1.1 Սահմանափակող ֆերմենտներ

1.1.1 սահմանափակող ֆերմենտների գործողության մեխանիզմը

1.1.2 Սահմանափակման քարտեզների կառուցում

1.3 Լիգաներ

2 Նոր գենի ներմուծում բջիջ

2.1 Պրոկարիոտներում գեների արտահայտման կարգավորումը

2.2 Բջիջ գենի ուղղակի ներմուծման մեթոդներ

2.3 Կաթնասունների բջիջներում գեների ներմուծում

2.4 Կաթնասունների սոմատիկ բջիջների գենետիկական փոխակերպում

2.5 Գենային թերապիա

2.6 Տրանսգենային կենդանիների արտադրություն

Եզրակացություն

Հղումներ

Ներածություն

Գենետիկական ճարտարագիտությունը ֆունկցիոնալ ակտիվ գենետիկական կառուցվածքների (ռեկոմբինանտ ԴՆԹ) in vitro կառուցումն է կամ այլ կերպ ասած՝ արհեստական ​​գենետիկական ծրագրերի ստեղծումը (Baev A. A.): Ըստ Է. Ս. Փիրուզյանի՝ գենետիկական ինժեներությունը փորձարարական տեխնիկայի համակարգ է, որը հնարավորություն է տալիս լաբորատորիայում (in vitro) կառուցել արհեստական ​​գենետիկական կառուցվածքներ՝ այսպես կոչված, ռեկոմբինանտ կամ հիբրիդային ԴՆԹ մոլեկուլների տեսքով։

Խոսքը ուղղորդված, ըստ կանխորոշված ​​ծրագրի, մարմնից դուրս մոլեկուլային գենետիկական համակարգերի կառուցման մասին է՝ դրանց հետագա ներմուծմամբ կենդանի օրգանիզմ։ Այս դեպքում ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն դառնում է ռեցիպիենտ օրգանիզմի գենետիկ ապարատի անբաժանելի մասը և նրան հաղորդում նոր յուրահատուկ գենետիկական, կենսաքիմիական, ապա ֆիզիոլոգիական հատկություններ։

Կիրառական գենետիկ ինժեներիայի նպատակն է նախագծել այնպիսի ռեկոմբինանտ ԴՆԹ մոլեկուլներ, որոնք գենետիկ ապարատի մեջ ներդնելով մարմնին օգտակար հատկություններ կտան մարդկանց համար:

Recombinant DNA տեխնոլոգիան օգտագործում է հետևյալ մեթոդները.

ԴՆԹ-ի հատուկ տրոհումը սահմանափակող նուկլեազների միջոցով, արագացնելով առանձին գեների մեկուսացումը և մանիպուլյացիան.

ԴՆԹ-ի մաքրված հատվածի բոլոր նուկլեոտիդների արագ հաջորդականացում, որը թույլ է տալիս որոշել գենի սահմանները և դրա կողմից կոդավորված ամինաթթուների հաջորդականությունը.

Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի կառուցում;

Նուկլեինաթթվի հիբրիդացում, որը թույլ է տալիս ավելի մեծ ճշգրտությամբ և զգայունությամբ հայտնաբերել հատուկ ՌՆԹ-ի կամ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը՝ հիմնվելով նուկլեինաթթուների լրացուցիչ հաջորդականությունները կապելու ունակության վրա.

ԴՆԹ-ի կլոնավորում. in vitro ուժեղացում՝ օգտագործելով պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա կամ ԴՆԹ-ի հատվածի ներմուծում բակտերիաների բջիջ, որը նման փոխակերպումից հետո վերարտադրում է այս հատվածը միլիոնավոր օրինակներով.

Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ներմուծում բջիջների կամ օրգանիզմների մեջ:

Գենային ինժեներիայի պատմություն

Գենետիկական ճարտարագիտությունը հայտնվեց կենսաքիմիայի և մոլեկուլային գենետիկայի տարբեր ճյուղերի բազմաթիվ հետազոտողների աշխատանքի շնորհիվ։ Երկար տարիներ սպիտակուցները համարվում էին մակրոմոլեկուլների հիմնական դասը։ Նույնիսկ ենթադրություն կար, որ գեները սպիտակուցային բնույթ են կրում։ Միայն 1944 թվականին Էվերին, ՄաքԼեոդը և Մաքքարթին ցույց տվեցին, որ ԴՆԹ-ն ժառանգական տեղեկատվության կրողն է: Այս պահից սկսվեց նուկլեինաթթուների ինտենսիվ ուսումնասիրությունը: Մեկ տասնամյակ անց՝ 1953 թվականին, Ջ. Ուոթսոնը և Ֆ. Քրիքը ստեղծեցին ԴՆԹ-ի երկշղթա մոդել։ Այս տարին համարվում է մոլեկուլային կենսաբանության ծննդյան տարի։

50-60-ական թվականների վերջում պարզվեցին գենետիկ կոդի հատկությունները, և 60-ականների վերջում փորձնականորեն հաստատվեց դրա ունիվերսալությունը։ Տեղի ունեցավ մոլեկուլային գենետիկայի ինտենսիվ զարգացում, որի օբյեկտներն էին E. coli-ն, նրա վիրուսներն ու պլազմիդները։ Մեթոդներ են մշակվել անձեռնմխելի ԴՆԹ-ի մոլեկուլների, պլազմիդների և վիրուսների բարձր մաքրված պատրաստուկների մեկուսացման համար: Վիրուսների և պլազմիդների ԴՆԹ-ն կենսաբանորեն ակտիվ ձևով ներմուծվել է բջիջներ՝ ապահովելով դրա վերարտադրությունը և համապատասխան գեների արտահայտումը։ 70-ականներին հայտնաբերվեցին մի շարք ֆերմենտներ, որոնք կատալիզացնում են ԴՆԹ-ի փոխակերպման ռեակցիաները։ Գենային ինժեներիայի մեթոդների մշակման գործում հատուկ դեր են պատկանում սահմանափակող ֆերմենտներին և ԴՆԹ-ի լիգաներին:

Գենային ինժեներիայի զարգացման պատմությունը կարելի է բաժանել երեք փուլի. Առաջին փուլը կապված է in vitro-ում ռեկոմբինանտ ԴՆԹ մոլեկուլների ստացման հիմնարար հնարավորության ապացուցման հետ։ Այս աշխատանքները վերաբերում են տարբեր պլազմիդների միջև հիբրիդների արտադրությանը։ Ապացուցված է բակտերիաների տարբեր տեսակների և շտամների սկզբնական ԴՆԹ մոլեկուլների միջոցով ռեկոմբինանտ մոլեկուլների ստեղծման հնարավորությունը, դրանց կենսունակությունը, կայունությունը և գործունեությունը:

Երկրորդ փուլը կապված է պրոկարիոտների և տարբեր պլազմիդների քրոմոսոմային գեների միջև ԴՆԹ-ի ռեկոմբինանտ մոլեկուլների ստացման աշխատանքների սկզբի հետ՝ ապացուցելով դրանց կայունությունն ու կենսունակությունը։

Երրորդ փուլը էուկարիոտ գեների, հիմնականում կենդանիների, վեկտորային ԴՆԹ-ի մոլեկուլների մեջ ընդգրկելու աշխատանքների սկիզբն է (ԴՆԹ օգտագործվում է գեների փոխանցման համար և կարող է ինտեգրվել ստացող բջջի գենետիկական ապարատին):

Ֆորմալ կերպով, գենետիկական ինժեներիայի ծննդյան ամսաթիվը պետք է համարել 1972 թվականը, երբ Սթենֆորդի համալսարանում Պ. Բերգը, Ս. Կոենը, Հ. Բոյերը և գործընկերները ստեղծեցին SV40 վիրուսի, բակտերիոֆագի և E. coli-ի ԴՆԹ-ի բեկորներ պարունակող առաջին ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն։ .

1 Գենետիկորեն մշակված ֆերմենտների հիմնական խմբերը

Գենետիկական ճարտարագիտությունը մոլեկուլային գենետիկայի ժառանգն է, բայց իր ծնունդը պարտական ​​է գենետիկ ֆերմենտաբանության և նուկլեինաթթուների քիմիայի հաջողություններին, քանի որ ֆերմենտները մոլեկուլային մանիպուլյացիայի գործիքներն են: Թեև մենք երբեմն կարող ենք աշխատել բջիջների և բջջային օրգանելների հետ՝ օգտագործելով միկրոմանիպուլյատորներ, նույնիսկ ամենափոքր միկրովիրաբուժական գործիքները չեն օգնի ԴՆԹ և ՌՆԹ մակրոմոլեկուլների հետ աշխատելիս: Ի՞նչ անել։ Ֆերմենտները գործում են որպես «սկալպել», «մկրատ» և «կարելու թել»։

Միայն նրանք կարող են գտնել որոշակի նուկլեոտիդային հաջորդականություններ, այնտեղ «կտրել» մոլեկուլը կամ, ընդհակառակը, «փակել» ԴՆԹ-ի շղթայում: Այս ֆերմենտները երկար ժամանակ աշխատում են բջիջներում՝ կատարելով աշխատանք բջիջների բաժանման ժամանակ ԴՆԹ-ի վերարտադրության (կրկնապատկման), վնասի վերականգնման (մոլեկուլի ամբողջականության վերականգնման), գենետիկական տեղեկատվության ընթերցման և բջիջից բջիջ կամ ներսում փոխանցման գործընթացներում։ մի բջիջ. Գենետիկ ինժեների խնդիրն է ընտրել մի ֆերմենտ, որը կկատարի հանձնարարված խնդիրները, այսինքն՝ կկարողանա աշխատել նուկլեինաթթվի որոշակի հատվածի հետ։

Պետք է նշել, որ գենետիկական ճարտարագիտության մեջ օգտագործվող ֆերմենտները չունեն տեսակների առանձնահատկություններ, ուստի փորձարարը կարող է իր ընտրած հաջորդականությամբ ցանկացած ծագման ԴՆԹ-ի բեկորները միավորել մեկ ամբողջության մեջ: Սա թույլ է տալիս գենետիկական ինժեներիային հաղթահարել բնության կողմից հաստատված տեսակների խոչընդոտները և իրականացնել միջտեսակային հատում:

Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի կառուցման մեջ օգտագործվող ֆերմենտները կարելի է բաժանել մի քանի խմբերի.

Ֆերմենտներ, որոնք արտադրում են ԴՆԹ-ի բեկորներ (սահմանափակող ֆերմենտներ);

Ֆերմենտներ, որոնք սինթեզում են ԴՆԹ-ի կաղապարը (պոլիմերազներ) կամ ՌՆԹ (հակադարձ տրանսկրիպտազներ);

ԴՆԹ-ի բեկորները միացնող ֆերմենտներ (լիգազներ);

Ֆերմենտներ, որոնք թույլ են տալիս փոփոխություններ կատարել ԴՆԹ-ի բեկորների ծայրերի կառուցվածքում:

1.1 Սահմանափակող ֆերմենտներ

Ընդհանրապես ընդունված է, որ «սահմանափակող ֆերմենտ», «սահմանափակող էնդոնուկլեազ» և «տեղորոշված ​​էնդոդօքսիրիբոնուկլեազ» տերմինները հոմանիշ են:

Բոլոր բակտերիաների սահմանափակման էնդոնուկլեազները ճանաչում են հատուկ, բավականին կարճ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները և կապվում դրանց հետ: Այս գործընթացն ուղեկցվում է ԴՆԹ-ի մոլեկուլի կտրումով կամ հենց ճանաչման վայրում, կամ որևէ այլ վայրում, որը որոշվում է ֆերմենտի տեսակով: Սահմանափակման ակտիվության հետ մեկտեղ բակտերիալ շտամն ունի ԴՆԹ-ի մեթիլացման հատկություն. Այս գործընթացը բնութագրվում է ԴՆԹ-ի հաջորդականության նույն յուրահատկությամբ, ինչ սահմանափակումը: Մեթիլազը մեթիլ խմբեր է ավելացնում ադենինի կամ ցիտոզինի մնացորդներին նույն տեղում, որտեղ կապվում է սահմանափակող ֆերմենտը: Մեթիլացման արդյունքում տեղանքը դառնում է սահմանափակման դիմացկուն։ Հետեւաբար, մեթիլացումը պաշտպանում է ԴՆԹ-ն կտրվելուց:

Գոյություն ունեն սահմանափակող ֆերմենտների 3 հիմնական դաս՝ 1, 2 և 3։

Բոլոր սահմանափակող ֆերմենտները ճանաչում են խիստ սահմանված հաջորդականությունները երկշղթա ԴՆԹ-ի վրա, սակայն 1-ին դասի սահմանափակող ֆերմենտները խախտում են ԴՆԹ-ի մոլեկուլի կամայական կետերում, իսկ 2-րդ և 3-րդ դասի սահմանափակող ֆերմենտները ճանաչում և կտրում են ԴՆԹ-ն խստորեն սահմանված կետերում կամ ճանաչման վայրերում: գտնվելու վայրը ֆիքսված նրանցից հեռավորության վրա:

1-ին և 3-րդ տիպերի ֆերմենտներն ունեն բարդ ենթամիավորի կառուցվածք և ունեն երկու տեսակի գործունեություն՝ փոփոխող (մեթիլացնող) և ATP-ից կախված էնդոնուկլեազ:

2-րդ դասի ֆերմենտները բաղկացած են 2 առանձին սպիտակուցներից՝ սահմանափակող էնդոնուկլեազից և փոփոխող մեթիլազից, հետևաբար, գենետիկական ճարտարագիտության մեջ օգտագործվում են միայն 2-րդ դասի ֆերմենտները: Նրանք պահանջում են մագնեզիումի իոններ որպես կոֆակտորներ:

Ներկայումս մեկուսացվել են 2-րդ դասի ավելի քան 500 սահմանափակող ֆերմենտներ, սակայն տարբեր միկրոօրգանիզմներից մեկուսացված ֆերմենտների թվում կան այնպիսիք, որոնք ճանաչում են ԴՆԹ-ի նույն հաջորդականությունները: Նման զույգերը կամ խմբերը կոչվում են իզոշիզոմերներ։ Տարբերակվում է իսկական իզոսխիզոմերիզմի միջև, երբ ֆերմենտները ճանաչում են միևնույն նուկլեոտիդային հաջորդականությունը և կոտրում ԴՆԹ-ն նույն կետերում, և կեղծ, երբ ֆերմենտները, ճանաչելով ԴՆԹ-ի նույն տեղանքը, առաջացնում են ընդմիջումներ նույն տեղանքի տարբեր կետերում:

2-րդ դասի սահմանափակող ֆերմենտների մեծ մասը ճանաչում է 4-ից 6 նուկլեոտիդային զույգ պարունակող հաջորդականություն, հետևաբար սահմանափակող ֆերմենտները բաժանվում են փոքր և մեծ կտրվածքի: Փոքր կտրվածքով սահմանափակող ֆերմենտները ճանաչում են տետրանուկլեոտիդները և մոլեկուլների մեջ շատ ավելի շատ ճեղքեր են մտցնում, քան մեծ կտրվածքով սահմանափակող ֆերմենտները, որոնք ճանաչում են վեց նուկլեոտիդ զույգերի հաջորդականությունը: Դա պայմանավորված է նրանով, որ չորս նուկլեոտիդների որոշակի հաջորդականության առաջացման հավանականությունը շատ ավելի մեծ է, քան վեց նուկլեոտիդների հաջորդականությունը։ Օրինակ, բակտերիոֆագ T7-ի ԴՆԹ-ին, որը բաղկացած է 40000 բազային զույգերից, չունի E. coli-ից R1 սահմանափակող ֆերմենտի կողմից ճանաչված հաջորդականություն:

Սահմանափակող ֆերմենտները Hpa II-ը և Alu-ն (Arthrobacter luteus-ից) փոքր ճեղքող ֆերմենտներ են, իսկ Eco R I-ը (Escherichia coli-ից) և Hind III-ը՝ խոշոր տրոհվողներ: Եթե ​​ենթադրենք, որ սահմանափակող ֆերմենտների ճանաչման վայրերը պատահականորեն բաշխված են ԴՆԹ-ի շղթայի երկայնքով, ապա չորս նուկլեոտիդներից բաղկացած հաջորդականությունը (տեղամաս) ճանաչող ֆերմենտների թիրախը պետք է լինի միջինը յուրաքանչյուր 256 բազային զույգում, իսկ վեց նուկլեոտիդ ճանաչող ֆերմենտների համար՝ յուրաքանչյուր 4096 հիմք: զույգեր. Եթե ​​սահմանափակման վայրը գտնվում է գենի ներսում, ապա ԴՆԹ սահմանափակող ֆերմենտով բուժումը կհանգեցնի դրա ապաակտիվացմանը։ Նման իրադարձության հավանականությունը շատ մեծ է փոքր կտրվածքով սահմանափակող ֆերմենտներով բուժելիս և աննշան է մեծ կտրվածքով էնդոնուկլեազներ օգտագործելիս: Հետևաբար, անձեռնմխելի գեն ստանալու համար տարանջատումն իրականացվում է հերթափոխով մի քանի մեծ կտրվածքով սահմանափակող ֆերմենտներով կամ օգտագործվում է «թերսահմանափակման» տեխնիկան, այսինքն. սահմանափակումն իրականացվում է այն պայմաններում, երբ ճեղքումը տեղի է ունենում միայն մեկ տեղամասում:

1.1.1 սահմանափակող ֆերմենտների գործողության մեխանիզմը

4-6 բազային զույգերի պալինդրոմները՝ սահմանափակման վայրերը, հաճախ հանդես են գալիս որպես թիրախ (ճանաչման վայրեր): Սահմանափակող ֆերմենտների կողմից ճանաչման կետերը սիմետրիկ են 180°C պտույտի նկատմամբ, այսինքն՝ մի շղթայում ձախից աջ նուկլեոտիդների հաջորդականությունը նույնն է, ինչ մյուսի աջից ձախ։ Համաչափությունը նշանակում է, որ նրանք, որոնք պետք է մեթիլացվեն, առաջանում են ԴՆԹ-ի երկու շղթաների վրա: Արդյունքում թիրախային տեղամասը կարող է ամբողջությամբ մեթիլացված լինել (երկու շղթաներն էլ փոփոխված են), կիսամեթիլացված (միայն մեկ շղթան մեթիլացված է) կամ չմեթիլացված։

Լիովին մեթիլացված կայքը ենթակա չէ ոչ սահմանափակման, ոչ էլ փոփոխման: Հեմիմեթիլացված տեղանքը չի ճանաչվում սահմանափակող ֆերմենտի կողմից, բայց կարող է վերածվել մեթիլազի կողմից ամբողջությամբ մեթիլացվածի: Բակտերիաներում մեթիլացումը սովորաբար կապված է գոյություն ունեցող մոդիֆիկացիոն վիճակի պահպանման հետ: Լիովին մեթիլացված ԴՆԹ-ի կրկնօրինակումը հանգեցնում է հեմիմեթիլացված ԴՆԹ-ի առաջացմանը: Հավանական է, որ հեմիմեթիլացված տեղամասերի ճանաչումը նորմալ քայլ է մեթիլազների գործունեության մեջ in vivo-ում:

Չմեթիլացված թիրախային տեղամասն ապահովում է ենթաշերտ կամ սահմանափակման կամ փոփոխման համար in vitro: Բջջում չձևափոխված ԴՆԹ-ն ավելի հավանական է, որ սահմանափակվի: Կտրող ռեակցիան իրականացվում է երկու փուլով. Նախ կտրվում է ԴՆԹ-ի մի շարանը, իսկ հետո՝ մոտակայքում: Կտրման վայրի յուրաքանչյուր կողմին հարող շրջաններում կարող է առաջանալ էկզոնուկլեոտիկ դեգրադացիա: Տեղի է ունենում ATP-ի արդյունավետ հիդրոլիզ, որի դերը դեռ պարզված չէ։

Ինչպե՞ս է ֆերմենտը ճանաչում մի տեղամաս և կտրում մյուսը՝ բավականին հեռավոր: Կարևոր է նշել, որ սպիտակուցը երբեք չի բաժանվում ԴՆԹ-ի մոլեկուլից, որին սկզբում կապված էր: Եթե ​​ֆերմենտը ինկուբացվում է փոփոխված և չմոդիֆիկացված ԴՆԹ-ի խառնուրդով, այն նախընտրելիորեն կտրում է չմոդիֆիկացված ԴՆԹ-ն: Հետևաբար, կապակցման վայրը ճանաչելիս սպիտակուցը չի առանձնանում չմեթիլացված ԴՆԹ-ից, որպեսզի գտնի կտրման վայրը:

Գոյություն ունեն երկու այլընտրանքային մոդելներ, որոնք բացատրում են ճանաչման և կտրման վայրերի փոխհարաբերությունները. դրանցից մեկի համաձայն շարժվում է ֆերմենտը, մյուսի համաձայն՝ ԴՆԹ-ն։ Եթե ​​ֆերմենտը շարժվում է, ապա նրա շարժումը ԴՆԹ-ի երկայնքով կշարունակվի այնքան ժամանակ, մինչև նա ընտրի կտրման վայր: Եթե ​​ԴՆԹ-ն շարժվում է, ֆերմենտը մնում է կցված ճանաչման վայրում, և ԴՆԹ-ն ձգվում է ֆերմենտի երկրորդ կապակցման վայրի միջով, և դա շարունակվում է այնքան ժամանակ, մինչև ֆերմենտը հասնի կտրման շրջան (դեռևս չբնութագրված): Էլեկտրոնային մանրադիտակային տվյալներ են ձեռք բերվել, որոնք ցույց են տալիս, որ ֆերմենտը առաջացնում է ԴՆԹ-ում օղակի ձևավորում և, ըստ երևույթին, կապված է ճանաչման վայրի հետ կտրումից հետո. այս տվյալները աջակցում են երկրորդ մոդելին:

1.1.2 Սահմանափակման քարտեզների կառուցում

Սահմանափակող ֆերմենտները դարձել են արդյունավետ հետազոտական ​​գործիք: Դրանք հնարավորություն են տալիս շատ մեծ ԴՆԹ մոլեկուլները վերածել մի քանի հարյուրից մինչև մի քանի հազար հիմքերի երկարությամբ բեկորների մի շարքի։ Օգտագործելով ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզ (տես բաժին 1), տարբեր չափերի ԴՆԹ-ի բեկորները հեշտությամբ կարելի է առանձնացնել, այնուհետև յուրաքանչյուր բեկոր կարող է առանձին հետազոտվել:

Կարճ բեկորները գաղթում են շատ ավելի արագ, քան երկարները: Ագարոզայի համեմատաբար բարձր կոնցենտրացիայի դեպքում խոշոր բեկորները ընդհանրապես չեն կարող թափանցել գել: Միգրացիայի ընթացքում սահմանափակող բեկորները չեն քայքայվում, դրանք կարող են զտվել (լվացվել) կենսաբանական ակտիվ երկշղթա մոլեկուլների տեսքով. ԴՆԹ կապող ներկերով գելերի ներկումը բացահայտում է ժապավենների մի շարք, որոնցից յուրաքանչյուրը համապատասխանում է սահմանափակող բեկորին, որի մոլեկուլային քաշը կարող է որոշվել հայտնի մոլեկուլային կշիռների ԴՆԹ-ով չափագրելով:

Գենոմի որոշակի շրջանի մի շարք սահմանափակող նուկլեազների հետ մշակելուց հետո ստացված ԴՆԹ-ի բեկորների չափերի համեմատությունը թույլ է տալիս կառուցել սահմանափակման քարտեզ, որը ցույց է տալիս յուրաքանչյուր սահմանափակման վայրի դիրքը այլ շրջանների նկատմամբ:

5000 նուկլեոտիդային զույգ (bp) երկարությամբ ԴՆԹ մոլեկուլ։ առանձին մշակվում է A և B սահմանափակող ֆերմենտներով: Բեկորները բաժանվում են էլեկտրոֆորեզով: Ա ֆերմենտը ԴՆԹ-ն կտրում է 2100, 1400, 1000 և 500 բ/պ 4 բեկորների։ Բուժման սահմանափակման ֆերմենտ B-ով ստացվել է 3 բեկոր՝ 2500, 1300 և 1200 bp: (նկ. 37): Այս ֆերմենտների սահմանափակման վայրերի գտնվելու վայրը որոշելու համար հաջորդ քայլը կրկնակի տրոհման ընթացակարգի օգտագործումն է. ԴՆԹ-ն մշակվում է երկու էնդոնուկլեազներով: Հետազոտվող բեկորը երկու սահմանափակող ֆերմենտներով միաժամանակ մշակելով՝ ստացվեց 6 բեկոր՝ 1900, 1000, 800, 600, 500, 200 բ/պ։

Բրինձ. 1. Էլեկտրոֆորեզի արդյունքները ԴՆԹ-ի բեկորը տարբեր սահմանափակող ֆերմենտներով մշակելուց հետո

Ամենաամբողջական տարբերակն այն է, որ մարսողության արդյունքում առաջացած յուրաքանչյուր բեկորը մաքրվի մեկ սահմանափակող ֆերմենտով և այն բուժվի երկրորդով: Այս մշակումից հետո ստացված բեկորների խառնուրդը նույնպես վերլուծվում է էլեկտրոֆորեզով։ Մեր օրինակում ստացվել են հետևյալ արդյունքները.

4 A-բեկորներից յուրաքանչյուրի մշակումը սահմանափակող ֆերմենտ B-ով

2100 - 1900 և 200 թթ.

1400 - 800 և 600,

500 - 500 (առանց փոփոխության)

B 3 բեկորներից յուրաքանչյուրի վերամշակում A սահմանափակող ֆերմենտով

2500 - 1900 և 600 թթ

1300 - 800 և 500 թթ

1200 - 1000 և 200 թթ

Արդյունքների վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ B սահմանափակող ֆերմենտով A բեկորների մարսման արդյունքում ստացված ֆերմենտներից յուրաքանչյուրը կարող է հայտնաբերվել A սահմանափակող ֆերմենտով B բեկորների մարսման արդյունքում ստացված նմուշներում: Սահմանափակման քարտեզագրման բանալին համընկնող բեկորներն են: Քննարկվող օրինակում դրանք B-fragment 2100 և A-fragment 2500 են: Երբ մշակվում է մեկ այլ սահմանափակող ֆերմենտի հետ, դրանք տալիս են 1900 հատված:

Այս բեկորների ճեղքման տվյալներից ենթադրում ենք, որ մի կողմից 200 բ/պ հեռավորության վրա։ 1900 բեկորից կա հաջորդ Ա-տեղանքը, իսկ մյուս ծայրում՝ 600 բ/պ հեռավորության վրա։ – հաջորդ B-կայքը (նկ. 38): Երկու էնդոնուկլեազներով բուժելիս 200 բ/պ բեկոր: ձևավորվում է մեկ անգամ, երբ մշակվում է B-բեկոր 1200-ից A սահմանափակող ֆերմենտով, այսինքն՝ 1200 հատվածն ընկած է ձախ կողմում: Մնում է որոշել, թե ինչպես է քարտեզը շարունակվում դեպի աջ: Ակնհայտ է, որ սա A-fragment 1400-ն է, քանի որ այն սահմանափակող ֆերմենտի միջոցով կտրված է 600 և 800 բեկորների: Ակնհայտ է, որ 1300 հատվածը պետք է տեղադրվի 1300-րդ հատվածի աջ կողմում 500 և B-բեկոր 1300-ի բաժանում A սահմանափակող ֆերմենտով 800-ի և 500-ի:

Սահմանափակման քարտեզներ կառուցելիս սովորաբար օգտագործվում են մի քանի սահմանափակումային ֆերմենտներ, ուստի անհրաժեշտ է վերլուծել տարբեր ֆերմենտների գործողությամբ ստացված բեկորների միջև բարդ հարաբերությունները: Քարտեզագրման ընթացակարգը պարզեցնելու համար կարող է օգտագործվել թերի պառակտումը: Որոշակի պայմաններում սահմանափակող ֆերմենտը չի ճանաչում և չի կտրում ԴՆԹ-ի մոլեկուլի բոլոր տեղամասերը: Օրինակ, երբ ԴՆԹ-ն մասնակիորեն մարսվում է A ֆերմենտով, կարող են առաջանալ 3100 bp և 1400 bp բեկորներ: եւ 500 bp Համեմատելով դրանք ամբողջական պառակտման տվյալների հետ (2100, 1400, 1000 և 500), կարող ենք անմիջապես 2100-ը և 1000-ը դնել իրար կողքի (հատված 3100)։ Եվ ստանալով 3500 բեկոր, մոտակայքում տեղադրեք 2100 bp: եւ 1400 bp

Բրինձ. 2. Սահմանափակման հատվածի վերլուծություն և ԴՆԹ-ի հատվածի քարտեզ

Մեկ այլ տեխնիկա է ռադիոակտիվ վերջի պիտակի ներդրումը: Վերջնական բեկորները որոշվում են այս դեպքում պիտակի ներառմամբ: Բեկորները կարող են համընկնել նաև նուկլեինաթթվի հիբրիդացման միջոցով: Համընկնող բեկորները (այս դեպքում 2100 և 2500) հիբրիդացված կլինեն:

Առաջին քարտեզը ստացվել է SV40 վիրուսի համար (սիմյան վիրուս, որն առաջացնում է չարորակ փոխակերպում), որը պարունակում է 5423 բազային զույգ։ Օգտագործվել է սահմանափակող Hind-II ֆերմենտը, որը վիրուսի շրջանաձև ԴՆԹ-ն բաժանում է 11 բեկորների։ ԴՆԹ-ում դրանց դասավորության կարգը հաստատվել է՝ ուսումնասիրելով բեկորների հավաքածուները, որոնք ձևավորվել են ճեղքման ավարտին հասնելու ընթացքում: Առաջին ընդմիջումը օղակի մոլեկուլը վերածեց գծայինի, որն այնուհետեւ բաժանվեց ավելի ու ավելի փոքր բեկորների: Սկզբում ուսումնասիրվել են համընկնող բեկորների հավաքածուներ, իսկ հետո՝ ամբողջական ճեղքման արտադրանքները: Այս կերպ ստացվել է շրջանաձև վիրուսային ԴՆԹ-ի սահմանափակման քարտեզ, որի վրա կիրառվել են սահմանափակող ֆերմենտի ճեղքման վայրեր։ Կրկնելով նմանատիպ փորձերը մեկ այլ սահմանափակող ֆերմենտի հետ՝ կարելի է ավելի մանրամասն քարտեզ ստանալ, որտեղ նշված են բազմաթիվ սահմանափակման վայրեր։

Նման տեղեկատվության շնորհիվ հնարավոր է բացահայտել ԴՆԹ-ի կենսաբանորեն կարևոր հատվածները: Քանի որ սահմանափակման քարտեզը արտացոլում է որոշակի նուկլեոտիդային հաջորդականության գտնվելու վայրը տվյալ տարածաշրջանում, նման քարտեզների համեմատությունը երկու կամ ավելի հարակից գեների համար թույլ է տալիս գնահատել նրանց միջև հոմոոլոգիան: Սահմանափակման քարտեզների վերլուծության միջոցով հնարավոր է համեմատել ԴՆԹ-ի որոշ հատվածներ տարբեր կենդանիների տեսակներից՝ առանց դրանց նուկլեոտիդային հաջորդականությունը որոշելու: Այսպես, օրինակ, պարզվել է, որ մարդկանց, օրանգուտանների և շիմպանզեների հեմոգլոբինի շղթաները կոդավորող քրոմոսոմային շրջանները գրեթե անփոփոխ են մնացել վերջին 5-10 միլիոն տարիների ընթացքում (տեսակի տարբերվելուց հետո):

Սահմանափակման քարտեզագրումը թույլ է տալիս տեսնել մեծ գենետիկ փոփոխություններ, ինչպիսիք են ջնջումները կամ ներդիրները: Այս դեպքում տեղի է ունենում սահմանափակման բեկորների նվազում կամ ավելացում, ինչպես նաև սահմանափակման վայրերի անհետացում կամ տեսք:

Քարտեզագրման մեթոդներից է մատնահետքը («մատնահետքի մեթոդ» կամ ԴՆԹ-մատնահետք): Այն ներառում է գենոմին բնորոշ բեկորների անկանոն և թերի հավաքածուների օգտագործում, թեև այն ամբողջությամբ չի նկարագրում:

1.2 Հակադարձ տրանսկրիպտազ

Հակադարձ տրանսկրիպտազը օգտագործվում է m-RNA-ի ԴՆԹ-ի կոմպլեմենտար շղթայի մեջ արտագրելու համար: Ռետրովիրուսներն ուսումնասիրելիս, որոնց գենոմը ներկայացված է միաշղթա ՌՆԹ մոլեկուլներով, պարզվել է, որ ներբջջային զարգացման ընթացքում ռետրովիրուսն անցնում է իր գենոմի ինտեգրման փուլը՝ երկշղթա ԴՆԹ-ի տեսքով հյուրընկալողի քրոմոսոմներում։ բջիջ. 1964 թվականին Թեմինը ենթադրեց վիրուսին հատուկ ֆերմենտի գոյության մասին, որը կարող է սինթեզել կոմպլեմենտար ԴՆԹ ՌՆԹ կաղապարի վրա։ Նման ֆերմենտի մեկուսացմանն ուղղված ջանքերը հաջողությամբ պսակվեցին, և 1970 թվականին Թեմինը և Միզուտանին, ինչպես նաև, անկախ Բալթիմորը, հայտնաբերեցին ցանկալի ֆերմենտը Rous սարկոմա վիրուսի արտաբջջային վիրուսների պատրաստման մեջ: ՌՆԹ-ից կախված այս ԴՆԹ պոլիմերազը կոչվում է հակադարձ տրանսկրիպտազ կամ ռեվերտազ:

Թռչնագրիպի ռետրովիրուսներից ստացված ռեվերտազը առավել մանրամասն ուսումնասիրվել է: Յուրաքանչյուր virion պարունակում է այս ֆերմենտի մոտ 50 մոլեկուլ: Հակադարձ տրանսկրիպտազը բաղկացած է երկու ենթամիավորներից՝ a (65 կԴա) և b (95 կԴա), որոնք առկա են հավասարամոլային քանակությամբ: Հակադարձ տրանսկրիպտազը ունի առնվազն երեք ֆերմենտային ակտիվություն.

1) ԴՆԹ պոլիմերազա, որն օգտագործում է և՛ ՌՆԹ, և՛ ԴՆԹ որպես ձևանմուշ.

2) RNase H-ի ակտիվությունը, որը հիդրոլիզացնում է ՌՆԹ-ն որպես ՌՆԹ-ԴՆԹ հիբրիդ, բայց ոչ միաշղթա կամ երկշղթա ՌՆԹ.

3) ԴՆԹ-ի էնդոնուկլեազի ակտիվությունը.

Առաջին երկու գործողությունները անհրաժեշտ են վիրուսային ԴՆԹ-ի սինթեզի համար, և էնդոնուկլեազը, ըստ երևույթին, կարևոր է վիրուսային ԴՆԹ-ն հյուրընկալող բջիջի գենոմում ինտեգրվելու համար: Մաքրված հակադարձ տրանսկրիպտազը սինթեզում է ԴՆԹ ինչպես ՌՆԹ-ից, այնպես էլ ԴՆԹ-ի կաղապարներից: Սինթեզը սկսելու համար ռեվերսետազը, ինչպես մյուս պոլիմերազները, պահանջում է կարճ երկշղթա շրջան (պրայմեր): Պրայմերը կարող է լինել և՛ ՌՆԹ-ի, և՛ ԴՆԹ-ի միաշղթա հատված, որը ռեակցիայի ընթացքում կովալենտորեն կապված է նոր սինթեզված ԴՆԹ շղթայի հետ:

Բրինձ. 3. ՌՆԹ-ի մոլեկուլների երկշղթա ԴՆԹ-ի պատճենների սինթեզի սխեմա.

Հակադարձ տրանսկրիպտազը հիմնականում օգտագործվում է սուրհանդակային ՌՆԹ-ն փոխլրացնող ԴՆԹ-ի (cDNA) փոխակերպելու համար: Հակադարձ արտագրման ռեակցիան իրականացվում է հատուկ ընտրված պայմաններում՝ օգտագործելով RNase ակտիվության ուժեղ արգելակիչներ: Այս դեպքում հնարավոր է ստանալ թիրախային ՌՆԹ-ի մոլեկուլների ԴՆԹ-ի ամբողջական պատճեններ։ Օլիգո (dT) օգտագործվում է որպես այբբենարան պոլի(A) պարունակող mRNA-ների հակադարձ տառադարձման համար, և ՌՆԹ-ի մոլեկուլների համար, որոնք չունեն 3"-պոլի(A) ծայրեր, քիմիական սինթեզված օլիգոնուկլեոտիդներ, որոնք լրացնում են 3"-ի վերջը: Օգտագործվում են ուսումնասիրվող ՌՆԹ: mRNA-ի վրա կոմպլեմենտար ԴՆԹ շղթայի սինթեզից և ՌՆԹ-ի քայքայումից հետո (սովորաբար օգտագործվում է ալկալիների բուժում) իրականացվում է երկրորդ ԴՆԹ շղթայի սինթեզ։ Այս դեպքում օգտագործվում է ռեվերսետազի՝ միաշղթա cDNA-ի 3 դյույմանոց ծայրերում ինքնալրացուցիչ մազակալներ ձևավորելու ունակությունը, որոնք կարող են ծառայել որպես այբբենարան։

Կաղապարը cDNA-ի առաջին շղթան է: Այս ռեակցիան կարող է կատալիզացվել E. coli-ի կամ ռեվերսազայի կամ ԴՆԹ պոլիմերազ I-ի միջոցով: Ցույց է տրվել, որ այս երկու ֆերմենտների համակցությունը հնարավորություն է տալիս մեծացնել ամբողջական երկշղթա cDNA մոլեկուլների ելքը։ Սինթեզի վերջում cDNA-ի առաջին և երկրորդ շղթաները մնում են կովալենտորեն կապված մազակալի օղակով, որը երկրորդ շղթայի սինթեզի ժամանակ ծառայել է որպես այբբենարան: Այս օղակը կտրված է էնդոնուկլեազ S1-ով, որը հատուկ ոչնչացնում է նուկլեինաթթուների միաշղթա հատվածները: Այս դեպքում ձևավորված ծայրերը միշտ չէ, որ բութ են, և հետագա կլոնավորման արդյունավետությունը բարձրացնելու համար դրանք վերանորոգվում են մինչև բութ՝ օգտագործելով E. coli ԴՆԹ պոլիմերազ I-ի Կլենովի բեկորը: Ստացված կրկնակի շղթա cDNA-ն այնուհետև կարող է տեղադրվել կլոնավորման վեկտորների մեջ, տարածվել որպես հիբրիդային ԴՆԹ մոլեկուլների մաս և օգտագործվել հետագա հետազոտությունների համար:

1.3 Լիգաներ

1961 թվականին Մեսելսոնը և Վեյգլը, օգտագործելով ֆագ l-ը որպես օրինակ, ցույց տվեցին, որ ռեկոմբինացիան ներառում է ԴՆԹ-ի մոլեկուլների կոտրումը և հետագա վերամիավորումը։ Սա նշանավորեց ԴՆԹ-ի բեկորների խաչաձեւ կապի մեջ ներգրավված ֆերմենտի որոնման սկիզբը: 1967 թվականին նման ֆերմենտ է հայտնաբերվել, որը կոչվում է ԴՆԹ լիգազ։ Այն կատալիզացնում է ֆոսֆոդիստերային կապի սինթեզը 2 շղթա նուկլեինաթթվի մոլեկուլում։

Այլ կերպ ասած, ԴՆԹ-ի լիգաները խաչաձեւ կապում են հարակից նուկլեոտիդները՝ կապ ստեղծելով շաքարի մնացորդների միջև։ ԴՆԹ-ի լիգաները բացարձակապես անհրաժեշտ են ԴՆԹ-ի վերականգնման գործընթացներում, վերարտադրման գործընթացներում՝ ԴՆԹ-ի շարանը կրկնապատկելիս:

Գոյություն ունեն ԴՆԹ-ի լիգաների 2 տեսակ, որոնք տարբերվում են կոֆակտորների պահանջներով և գործողության եղանակով։ E. coli ԴՆԹ լիգազան որպես կոֆակտոր օգտագործում է դիֆոսֆոպիրիդին նուկլեոտիդ, իսկ T4 ֆագ լիգազան օգտագործում է ATP Mg2+-ի առկայության դեպքում: T4 ֆագային լիգազան ավելի ունիվերսալ է, քանի որ բացի կպչուն ծայրերը կապելուց, այն ունակ է կատալիզացնելու ռեակցիան՝ կրկնակի շղթա ԴՆԹ-ի բեկորները բութ ծայրերով միացնելու ռեակցիան: Այն օգտագործվում է ավելի հաճախ:

2 Նոր գենի ներմուծում բջիջ

Ռեկոմբինանտ գենը կարող է բջիջ ներմուծվել 2 եղանակով՝ օգտագործելով վեկտորներ կամ ուղղակի ներածություն։

Վեկտորի ԴՆԹ-ի պահանջները, դրա կազմը

Վեկտորը ԴՆԹ կամ ՌՆԹ մոլեկուլ է, որը բաղկացած է երկու բաղադրիչից՝ վեկտորային մասից (կրողից) և կլոնավորված օտար գենից։ Վեկտորի խնդիրն է առաքել ընտրված ԴՆԹ-ն ստացող բջիջին, ինտեգրել այն գենոմի մեջ, թույլ տալ վերափոխված բջիջների նույնականացումը և ապահովել ներմուծված գենի կայուն արտահայտումը:

Այսպիսով, վեկտորը պետք է լինի փոքր, ունակ պահպանվի հյուրընկալ բջիջում (կրկնօրինակվի), բազմիցս պատճենվի (ուժեղացվի), արտահայտի համապատասխան գենը (պարունակի համապատասխան կարգավորող հաջորդականություն), պետք է ունենա մարկեր գեն, որը թույլ է տալիս տարբերակել հիբրիդային բջիջներ դրանց արդյունավետ ընտրության համար; պետք է կարողանա տեղափոխվել համապատասխան օրգանիզմի բջիջ։

Գենի կայուն արտահայտման համար պատասխանատու կարգավորող հաջորդականությունները կքննարկվեն ավելի ուշ:

Կարելի է առանձնացնել մարկերային գեների երկու խումբ, որոնք թույլ են տալիս տարբերակել փոխակերպված բջիջները.

1. Ընտրովի գեներ, որոնք պատասխանատու են հակաբիոտիկների (կանամիցին, տետրացիկլին, նեոմիցին և այլն), թունաքիմիկատների (բույսերի մեջ) նկատմամբ կայունության համար։ Սրանք կարող են լինել որոշ սուբստրատի ավքսոտրոֆիայի գեներ և այլն: Նման մարկերի գործողության հիմնական սկզբունքը փոխակերպված բջիջների կարողությունն է աճել ընտրովի սննդարար միջավայրի վրա՝ որոշակի նյութերի ավելացումով, որոնք արգելակում են չվերափոխված, նորմալ բջիջների աճն ու բաժանումը:

2. Բջջային չեզոք սպիտակուցներ կոդավորող ռեպորտաժային գեներ, որոնց առկայությունը հյուսվածքներում հեշտությամբ կարելի է ստուգել:

Ամենից հաճախ օգտագործվող ռեպորտաժային գեներն են β-գլյուկուրոնիդազը (GUS), կանաչ լյումինեսցենտ սպիտակուցը (GFP), լյուցիֆերազը (LUC) և քլորամֆենիկոլ ացետիլտրանսֆերազը (CAT): Մինչ օրս այս զինանոցից առավել հաճախ օգտագործվող գեներն են GUS-ը և GFP-ն և, ավելի քիչ, LUC-ն և CAT-ը: Ներկայումս օգտագործվում է որպես ռեպորտաժային գեն, GUS-ը Escherichia coli-ից մոդիֆիկացված գեն է, որը կոդավորում է 68 կԴա β-գլյուկուրոնիդազը: GUS-ն ակտիվ է շրջակա միջավայրի պայմանների լայն շրջանակում` օպտիմալ pH 5-8 և 37°C: Այն կարող է հիդրոլիզացնել բնական և սինթետիկ գլյուկուրոնիդների լայն տեսականի՝ թույլ տալով ընտրել համապատասխան ենթաշերտեր՝ ֆերմենտի ակտիվության սպեկտրոֆոտոմետրիկ կամ ֆտորոմետրիկ որոշման, ինչպես նաև հյուսվածքների in situ հիստոքիմիական ներկման համար (օրինակ՝ կապույտ): Ֆերմենտը բավականին կայուն է. դիմացկուն է ջերմության (55°C ջերմաստիճանի դեպքում կիսա կյանքը մոտ 2 ժամ է) և լվացող միջոցների գործողության նկատմամբ։ Սառեցման-հալեցման գործընթացում GUS-ի ակտիվության կորուստ չկա: Գենային ինժեներիայի մեթոդներով ստեղծված քիմերային սպիտակուցներում GUS-ը սովորաբար պահպանում է իր ֆունկցիոնալ ակտիվությունը։ Կենդանի բջիջներում GUS սպիտակուցը նույնպես շատ կայուն է և ակտիվ մի քանի ժամից մինչև մի քանի օր:

GFP-ն (կանաչ լյումինեսցենտային սպիտակուց - կանաչ լյումինեսցենտ սպիտակուց կամ կանաչ ֆլուորեսցենտային սպիտակուց) հայտնաբերվել է Շիմոմուրայի և այլոց կողմից: 1962 թվականին Aequorea victoria լուսատու մեդուզայում։ GFP գենը կլոնավորվեց 1992 թվականին Պրաշերի և այլոց կողմից, և մի քանի տարվա ընթացքում այս գենի ակտիվ օգտագործումը որպես ռեպորտաժային գեն սկսեց աշխատել մի շարք պրո և էուկարիոտիկ օրգանիզմների հետ: Ներկայումս GFP գենը օգտագործվում է աշխարհի հարյուրավոր հետազոտություններում, և դրանց թիվը արագորեն աճում է: Նման արագ աճը պայմանավորված է GFP սպիտակուցի հատուկ հատկություններով, մասնավորապես՝ սպեկտրի տեսանելի (կանաչ) հատվածում ֆլուորեսցիայի ունակությամբ, երբ ճառագայթվում է երկարալիք ուլտրամանուշակագույնով: Այս ֆլուորեսցենցիան առաջանում է անմիջապես սպիտակուցի կողմից և դրա դրսևորման համար չեն պահանջում սուբստրատներ կամ կոֆակտորներ: Այս հատկության շնորհիվ GFP գենը շատ խոստումնալից ռեպորտաժային գեն է, որը թույլ է տալիս մի շարք ինտրավիտալ (ոչ կործանարար) ուսումնասիրություններ տրանսգենային օրգանիզմների հետ:

GFP-ի բազմաթիվ ածանցյալներ միասին կոչվում են AFP (autofluorescent proteins): Ծովային անեմոնից Discosoma sp. Վերջերս մեկուսացվել է մեկ այլ սպիտակուց՝ DsRed-ը, որը լուսարձակվում է կարմիր լույսի ներքո: Վերջերս Ռուսաստանի Գիտությունների ակադեմիայի գիտնականները մեկուսացրել են ևս մի քանի նմանատիպ լյումինեսցենտ սպիտակուցներ Anthozoa կարգի տարբեր մարջանային պոլիպներից: Այն կարող է այլասերվել շատ բարձր ջերմաստիճանների, pH-ի ծայրահեղ արժեքների կամ ուժեղ վերականգնող նյութերի, ինչպիսին է Na2SO4-ը: Երբ վերադառնում է ֆիզիոլոգիական պայմաններին, GFP-ն մեծապես վերականգնում է իր ֆլյուորեսցիայի կարողությունը: Գենային ինժեներիայի մեթոդներով ստեղծված քիմերային սպիտակուցներում GFP-ն սովորաբար պահպանում է իր ֆունկցիոնալ ակտիվությունը։ Կենդանի բջիջներում GFP սպիտակուցը նույնպես շատ կայուն է:

CAT - գեներ, որոնք պատասխանատու են քլորամֆենիկոլ ացետիլտրանսֆերազի սինթեզի համար (մեկուսացված Escherihia coli-ից): Այս ֆերմենտը կատալիզացնում է ացետիլ խմբի տեղափոխումը ացետիլ-CoA-ից քլորամֆենիկոլ: Այն որոշվում է հիստոքիմիական եղանակով՝ համապատասխան սուբստրատի ավելացման դեպքում հյուսվածքների գույնի փոփոխությամբ:

LUC - գենը կոդավորում է լյուցիֆերազ ֆերմենտը (կլոնավորված բակտերիայից և կայծոռիկներից): Այն առաջացնում է փոխակերպված բջիջների փայլ: Բակտերիալ ֆերմենտը բաղկացած է երկու ենթամիավորներից. Ֆերմենտների ակտիվությունը որոշելու համար անհրաժեշտ է հատուկ սարքավորում՝ ֆտորաչափ և լուսային ազդանշանի ուժեղացուցիչով թվային տեսախցիկ։ Ֆերմենտը կորցնում է ակտիվությունը, երբ ենթարկվում է լվացող միջոցների և բարձր ջերմաստիճանի: Տրանսգենային բույսերի ընտրության ժամանակ ընտրովի գեները ռեպորտաժներով փոխարինելը հաճախ շատ ցանկալի է, քանի որ ռեպորտաժային գեների օգտագործման դեպքում շրջակա միջավայրի և մարդու առողջության համար հնարավոր ռիսկերի հավանականությունը գործնականում բացառվում է: Այնուամենայնիվ, ռեպորտաժային գեների շրջանակն ավելի լայն է, քան տրանսգենեզի վերահսկումը: Լրագրող գեների մեկ այլ և ակնհայտորեն ավելի կարևոր նպատակը տվյալ գենի արտահայտման ժամանակային և տարածական օրինաչափությունների բացահայտումն է (որքան հնարավոր է քանակապես)՝ անկախ նրանից, թե օտար: Հաղորդագրող գենը միայն պրոմոութեր շրջանին կցելը հնարավորություն է տալիս իր «մաքուր ձևով» ուսումնասիրել նրա դերը հետազոտվող գենի արտահայտումը տրանսկրիպցիոն մակարդակում կարգավորելու գործում:

Գենի սպիտակուցը կոդավորող շրջանը ռեպորտորով փոխարինելով՝ պահպանելով mRNA-ի 5» տերմինալային չթարգմանված հաջորդականությունը կոդավորող շրջանը թույլ է տալիս գնահատել այս հաջորդականության դերը mRNA-ի միջուկից ցիտոպլազմա տեղափոխման գործընթացներում։ և թարգմանության մեկնարկը։

Գենի ամենակարևոր հատկություններից մեկը նրա արտահայտվելու ունակությունն է։ Այս հատկության համար պատասխանատու են տարբեր գենետիկ տարրեր, որոնք մենք պետք է ինտեգրենք գենը կրող վեկտորի մոլեկուլին։

2.1 Պրոկարիոտներում գեների արտահայտման կարգավորումը

Շատ բակտերիաների գեներ նախագծված են այնպես, որ նրանք կարող են գործել զգալիորեն տարբեր արդյունավետությամբ: E. coli-ում, օրինակ, տարբեր սպիտակուցների հարաբերական առատությունը շատ լայնորեն տատանվում է (0,1%-ից մինչև 2%)՝ կախված դրանց գործառույթներից. Ավելին, E. coli քրոմոսոմի յուրաքանչյուր սպիտակուց կոդավորված է մեկ գենով: Նման տատանումները պայմանավորված են գենային արտահայտման վերահսկման համակարգի գործողությամբ, որն իրականացվում է հիմնականում ԴՆԹ-ի տրանսկրիպցիայի մակարդակով։ Այսպիսով, ամենից հաճախ գենի ակտիվության մակարդակը կապված է դրա վրա սինթեզված mRNA-ի քանակի հետ, այսինքն՝ ՌՆԹ պոլիմերազային ֆերմենտի ակտիվության հետ։

ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները, որոնք տեղակայված են կառուցվածքային գենի մեկնարկից առաջ և որոշում են ՌՆԹ պոլիմերազի ակտիվության աստիճանը, կոչվում են կարգավորող հաջորդականություններ։ Այս հաջորդականություններից մեկը ԴՆԹ-ի այն շրջանն է, որին կապվում է ՌՆԹ պոլիմերազը: Այս շրջանը կոչվում է պրոմոութեր:

Պրոմոտոր հիմքերի հաջորդականությունը որոշում է mRNA սինթեզի մեկնարկի հաճախականությունը, և այս հաջորդականությամբ մեկ բազայի փոխարինումը կարող է հանգեցնել սկզբնավորման հաճախականության 1000 անգամ նվազմանը:

Փրոմոութերը կարող է լինել ուժեղ կամ թույլ: Ուժեղ խթանիչը հաճախ սկսում է mRNA սինթեզը, թույլ պրոմոտորը շատ ավելի հազվադեպ: Մյուս կողմից, պրոմոութերը կարող է կարգավորվել կամ չկարգավորվել: Օրինակ, β-լակտամազային պրոմոութերը չկարգավորված է, բայց ուժեղ: Նման խթանիչների օգտագործումը միշտ չէ, որ հարմար է: Բանն այն է, որ մեծ քանակությամբ սպիտակուցը կարող է արգելափակել բակտերիաների աճը: Բացի այդ, ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի չափազանց մեծ արտագրումը կարող է խանգարել պլազմիդի վերարտադրությանը և այն կկորչի: Ուստի ավելի հարմար է օգտագործել կարգավորվող ուժեղ պրոմոութերներ (ինդուկտիվ), որոնց ընդգրկումը, հետևաբար օտար սպիտակուցի սինթեզը կարող է իրականացվել բակտերիալ մեծ զանգված ստանալու դեպքում։

Որոշ պլազմիդային վեկտորներ պարունակում են պրոմոութեր, որի աշխատանքը կարգավորվում է ռեպրեսորային գենի ջերմաստիճանի նկատմամբ զգայուն սպիտակուցային արտադրանքով։ Ռեպրեսորային սպիտակուցը ակտիվ է որոշակի ջերմաստիճաններում և արգելափակում է պրոմոութերի գործողությունը: Ջերմաստիճանը բարձրացնելով մինչև 42 °C՝ կարող եք «միացնել» պրոմոութերը և արագ ստանալ անհրաժեշտ սպիտակուցի մեծ քանակություն։

Որպես ինդուկտիվ խթանիչներ օգտագործվում են նաև տրիպտոֆան օպերոնի Trp պրոմոուտերը, որը կարգավորվում է տրիպտոֆանի քաղցով, լակտազային օպերոնի lac պրոմոութերը, որն առաջանում է սուբստրատի կողմից (լակտոզա) և այլն։

Որոշ կառուցվածքային գեների տրանսկրիպցիայի ինտենսիվությունը կարող է կախված լինել դրա դադարեցման արդյունավետությունից, մասնավորապես, նրանից, թե որքան հաճախ է ՌՆԹ պոլիմերազը դադարեցնում ՌՆԹ սինթեզը մինչ այդ գեներին հասնելը: Համեմատաբար վերջերս հայտնաբերվեց, որ E. coli-ի շատ օպերոններում, որոնք վերահսկում են ամինաթթուների կենսասինթեզը, գոյություն ունի ավարտման հաջորդականություն պրոմոտորի և առաջին կառուցվածքային գենի միջև: Որոշակի պայմաններում ձևավորվում է ավարտման ազդանշան, որը թուլացնում է տառադարձման ինտենսիվությունը։

Այս երեւույթը կոչվում է թուլացում, իսկ ԴՆԹ-ի հատվածը կոչվում է թուլացնող (թուլացնող): Ինչպես ռեպրեսիան, թուլացումը կախված է շրջակա միջավայրում համապատասխան ամինաթթուների առկայությունից: Օրինակ, տրիպտոֆանի ավելցուկը տրիպտոֆանից կախված մուտանտների բջիջներում, որոնք թերի են ռեպրեսորում, ՌՆԹ պոլիմերազի 10 մոլեկուլներից միայն 1-ը, որոնք սկսում են տրանսկրիպցիան, հաղթահարում են թուլացնողը և կարդում գենի կառուցվածքը: Տրիպտոֆանի հեռացումը եռապատկում է գեների արտագրման արդյունավետությունը: Ի տարբերություն ռեպրեսիայի, անտենուացիան կախված է ոչ թե բուն ամինաթթվից, այլ տրիպտոֆանիլ-tRNA-ից (համապատասխան tRNA-ին կցված ամինաթթու):

Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի արտադրողականության արդյունավետության վրա էականորեն ազդում է այս ԴՆԹ-ի մեկ բջջի կրկնօրինակների քանակը: Արտահայտված գենի ընդհանուր ակտիվությունը մեծանում է պլազմիդի կրկնօրինակների քանակի աճով: Այսպիսով, օգտագործելով բազմապատճենային պլազմիդներ, հնարավոր է հասնել ցանկալի սպիտակուցային արտադրանքի սուպերսինթեզի։ Սովորաբար օգտագործվող պլազմիդային վեկտորները (pBR 322 և այլն) պահվում են խցում 20-50 օրինակի չափով: Այժմ հետազոտողները իրենց տրամադրության տակ ունեն ջերմաստիճանի նկատմամբ զգայուն մուտանտ պլազմիդներ, որոնք կարող են կուտակել մինչև մեկից երկու հազար օրինակ յուրաքանչյուր բջջի համար՝ չխախտելով նրա կենսական գործառույթները: Այս կերպ հնարավոր է լինում հասնել պլազմիդային գեների գերարտադրության՝ բակտերիաների գերարտադրող շտամների կողմից։

E. coli-ում արտահայտման կարգավորումը տեղի է ունենում նաև թարգմանչական մակարդակում: 6-8 նուկլեոտիդների երկարությամբ հիմքերի հաջորդականությունը, որը գտնվում է AUG-ի մեկնարկային կոդոնից անմիջապես առաջ, որոշում է թարգմանության արդյունավետությունը: Այս հաջորդականությունը ներկայացնում է mRNA-ի միացման վայրը ռիբոսոմին: Որպես կանոն, այն գտնվում է սկզբնական կոդոնից 8 նուկլեոտիդ, և դրա տեղաշարժը այս կամ այն ​​ուղղությամբ կարող է կտրուկ նվազեցնել համապատասխան mRNA-ի թարգմանության արդյունավետությունը։ Նկարագրված շրջանը կոչվում է Շեյն-Դալգարնո հաջորդականություն, որն անվանվել է այն հետազոտողների պատվին, ովքեր առաջին անգամ հայտնաբերել են այն:

Ի թիվս այլ բաների, վեկտորը պետք է ներառի մարկերային գեն, որը թույլ է տալիս ընտրել փոփոխված բջիջները: Հաճախ ֆերմենտների գեները, որոնք տարածված են բնության մեջ, փոփոխում են հակաբիոտիկները և ապաակտիվացնում դրանց ազդեցությունը, օգտագործվում են որպես ընտրովի:

Էուկարիոտիկ գենոմի կազմակերպման առանձնահատկությունները

Էուկարիոտ օրգանիզմներում տրանսկրիպցիոն կարգավորման մեխանիզմը շատ ավելի բարդ է։ Էուկարիոտային գեների կլոնավորման և հաջորդականության արդյունքում հայտնաբերվել են տրանսկրիպցիա և թարգմանություն ներգրավված հատուկ հաջորդականություններ։

Էուկարիոտիկ բջիջը բնութագրվում է.

1. ԴՆԹ-ի մոլեկուլում ինտրոնների և էկզոնների առկայությունը:

2. mRNA-ի հասունացում՝ ինտրոնների հեռացում և էկզոնների կարում։

3. Տրանսկրիպցիան կարգավորող կարգավորող տարրերի առկայությունը, ինչպիսիք են՝ ա) պրոմոութերները՝ 3 տեսակ, որոնցից յուրաքանչյուրի վրա նստած է կոնկրետ պոլիմերազ։ Pol I-ը կրկնօրինակում է ռիբոսոմային գեները, Pol II-ը՝ սպիտակուցային կառուցվածքային գեները, Pol III-ը՝ փոքր ՌՆԹ-ներ կոդավորող գեները: Pol I և Pol II պրոմոութերը գտնվում են տրանսկրիպցիայի մեկնարկի վայրի դիմաց, Pol III պրոմոուտերը գտնվում է կառուցվածքային գենի մեջ. բ) մոդուլատորներ - ԴՆԹ-ի հաջորդականություններ, որոնք բարձրացնում են տրանսկրիպցիայի մակարդակը. գ) ուժեղացուցիչներ - հաջորդականություններ, որոնք բարձրացնում են տրանսկրիպցիայի մակարդակը և գործում են անկախ իրենց դիրքից գենի կոդավորող մասի և ՌՆԹ-ի սինթեզի մեկնարկային կետի վիճակից. դ) տերմինատորներ - հատուկ հաջորդականություններ, որոնք դադարեցնում են ինչպես թարգմանությունը, այնպես էլ արտագրումը:

Այս հաջորդականությունները տարբերվում են պրոկարիոտային հաջորդականություններից իրենց առաջնային կառուցվածքով և տեղակայմամբ՝ սկզբնական կոդոնի համեմատ, և բակտերիալ ՌՆԹ պոլիմերազը չի «ճանաչում» դրանք։ Այսպիսով, պրոկարիոտային բջիջներում էուկարիոտ գեների արտահայտման համար գեները պետք է լինեն պրոկարիոտային կարգավորող տարրերի հսկողության տակ։ Այս հանգամանքը պետք է հաշվի առնել արտահայտչական վեկտորներ կառուցելիս։

2.2 Բջիջ գենի ուղղակի ներմուծման մեթոդներ

Գենի ուղղակի ներմուծումը բջիջ իրականացվում է մի քանի եղանակով.

1. Տրանսֆեկցիա

2. Միկրոներարկում

3. Էլեկտրոպորացիա

5. Փաթեթավորում լիպոսոմներում

6. Էլեկտրոնային ատրճանակ

Տրանսֆեկցիայի ընթացքում ԴՆԹ-ն ներծծվում է կալցիումի ֆոսֆատի բյուրեղների վրա (Graham Van der Eb, 1973): Ձևավորվում են կալցիումի նստվածքի մասնիկներ։ Բջջի կողմից դրանք ընդունվում են ֆագոցիտոզով։

Փոխակերպման արդյունավետությունը բարձրացնելու համար ԴՆԹ-ի ոչ սպեցիֆիկ կրիչն ավելացվում է հատուկ ԴՆԹ-ին, որը պարունակում է այն գենը, որի համար կկատարվի ընտրություն: Որպես կանոն, այդ նպատակով ԴՆԹ-ն վերցվում է հորթի տիմուսից կամ սաղմոնի սերմից: ԴՆԹ-ի մի մասը կապվում է թաղանթին և չի մտնում բջիջներ։ ԴՆԹ-ն ընդունվում է բջիջների 15-ից 90%-ի կողմից: Ընդունումից մի քանի օր անց բջիջների մի փոքր մասն ի վիճակի է արտահայտել օտար գեներ, բայց հետո արտահայտման մակարդակն իջնում ​​է, և 10-3-10-5 բջիջները ենթարկվում են քիչ թե շատ կայուն փոխակերպման:

DEAE-dextran՝ պոլիմեր, որը կլանում է ԴՆԹ-ն, նույնպես օգտագործվում է տրանսֆեկցիայի համար։ Բջիջների մուտքի էֆեկտը և արտահայտման ժամանակը բարձր են, սակայն կայուն փոխակերպման հաճախականությունը ավելի ցածր է, քան կալցիումի նստվածք օգտագործելիս: Տրանսֆեկցիայի հաճախականությունը մեծանում է գլիցերինային շոկի միջոցով (4 րոպե 15% գլիցերինի լուծույթում HEPES բուֆերում):

Ցանկացած գեն կարող է ներմուծվել բջիջներ, եթե այն նախկինում կապակցված է կլոնավորված ընտրվող մարկերով: Այնուամենայնիվ, հետագա ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ բջիջից դուրս կապելը անհրաժեշտ չէ: Բջիջները, որոնք կլանում են ընտրովի գենը, կլանում են նաև կալցիումի նստվածքում առկա այլ ԴՆԹ: Այսպիսով, օգտագործելով կոտրանսֆորմացիայի մեթոդը, գրեթե ցանկացած կլոնավորված ԴՆԹ-ի հատվածը կարող է ներմուծվել աճեցված էուկարիոտ բջիջների մեջ, եթե այս ԴՆԹ-ն ներառվի խառնուրդում ընտրովի մարկերի հետ՝ կալցիումի նստվածք ձևավորելու համար:

Տրանսֆեկցիայի համար կարող են օգտագործվել քրոմոսոմներ կամ քրոմոսոմների բեկորներ: Դոնոր բջիջները արգելափակված են միտոզի փուլում: Միտոտիկ քրոմոսոմներն ազատվում են օսմոտիկ շոկի և միատարրացման ազդեցության տակ։ Դրանք մաքրվում են դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգմամբ: Քրոմոսոմները կալցիումի քլորիդով կուտակվում են բջիջների մակերեսին, և մի քանի ժամ հետո դրանք մշակվում են ռեագենտով, որը կարող է ծակել թաղանթները (օրինակ՝ գլիցերին):

Ստացող բջիջները մշակելու համար օգտագործվում են կոպիտ մաքրված քրոմոսոմային պատրաստուկներ, քանի որ քրոմոսոմները ամենաքիչն են ոչնչացվում: 1 բջիջ մշակելու համար քրոմոսոմների թիվը սահմանափակ է։ Ավելի լավ է օգտագործել ոչ ավելի, քան 20 քրոմոսոմ 1 ստացող բջջի համար, քանի որ կասեցման մեջ քրոմոսոմների բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում դրանք սոսնձվում են: Ստացող բջիջը պարունակում է դոնորային քրոմոսոմների բեկորներ, որոնք կարող են ինտեգրվել գենոմի մեջ և կարող են ինքնուրույն վերարտադրվել: Ներածված հատվածներում հաճախ նկատվում են ջնջումներ։

Ոչ բոլոր բջիջներն են ընդունակ փոխակերպելու գենոմային ԴՆԹ-ն բարձր հաճախականությամբ: Մարդու ֆիբրոբլաստները արդյունավետ կերպով ներառում են պլազմիդային ԴՆԹ և հազիվ են ներառում գենոմային ԴՆԹ:

ԴՆԹ-ի միկրոներարկումը կաթնասունների բջիջներում հնարավոր դարձավ 0,1-0,5 մկմ տրամագծով միկրոպիպետների և միկրոմանիպուլյատորի արտադրության սարքի հայտնվելով (նկ. 45): Այսպիսով, հերպեսի վիրուսի մի հատված պարունակող պլազմիդներ՝ թիմիդին կինազա (TK) գենով և պլազմիդ pBR322 ներարկվել են TK բջիջներ և ցույց են տվել, որ TK գենը ներթափանցել է միջուկներ և նորմալ վերարտադրվել դրանցում։ ԴՆԹ-ի ներմուծման մեթոդը միկրոներարկման միջոցով մշակվել է 70-ականների սկզբին Անդերսոնի և Դիակումակոսի կողմից: Սկզբունքորեն լավ սարքավորումների դեպքում 1 ժամում կարելի է ներարկել 500-1000 բջիջ, իսկ լավագույն փորձերի ժամանակ բջիջների 50%-ում նկատվում է ներարկվող գեների կայուն ինտեգրում և արտահայտում։ Նկարագրված մեթոդի առավելությունը նաև այն է, որ այն թույլ է տալիս ցանկացած ԴՆԹ ներմուծել ցանկացած բջիջ, և բջիջներում ներմուծված գենը պահպանելու համար ընտրովի ճնշում չի պահանջվում։

Բրինձ. 4. ԴՆԹ-ի ներմուծում միկրոներարկումով

Էլեկտրոպորացիան հիմնված է այն փաստի վրա, որ բարձր լարման իմպուլսները շրջելիորեն մեծացնում են կենսամեմբրանների թափանցելիությունը։ Բջիջները և ԴՆԹ-ի բեկորները, որոնք պետք է ներմուծվեն բջիջների մեջ, ավելացվում են էլեկտրապորացիայի միջավայրին (նկ. 46): Բարձր լարման իմպուլսները (լարումը 200 - 350 Վ, իմպուլսի տևողությունը 54 մվ) անցնում են միջավայրով, ինչը հանգեցնում է ցիտոպլազմիկ թաղանթում ծակոտիների առաջացման (էլեկտրական քայքայում), որոնց կյանքի տևողությունը և չափը բավարար են այնպիսի մակրոմոլեկուլների համար, ինչպիսիք են ԴՆԹ-ն։ օսմոտիկ ուժերի գործողության արդյունքում արտաքին միջավայրից բջիջ մտնել. Միաժամանակ մեծանում է բջջի ծավալը։

Էլեկտրական դաշտի ուժգնությունը և դրա գործողության տևողությունը, փոխակերպվող ԴՆԹ-ի և ստացող բջիջների կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր բջջային համակարգի համար ընտրվում են փորձարարական եղանակով՝ գոյատևած բջիջների կողմից ԴՆԹ-ի կլանման բարձր տոկոսի հասնելու համար: Ցույց է տրվել, որ էլեկտրապորացիայի օպտիմալ պայմաններում փոխակերպիչների թիվը կարող է հասնել գոյատևած բջիջների 80%-ին:

Էլեկտրոպորացիան ֆիզիկական, այլ ոչ թե կենսաքիմիական մեթոդ է, և, ըստ երևույթին, դա է պատճառը, որ այն լայնորեն կիրառվում է: Բազմաթիվ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ էլեկտրոպորացիան կարող է հաջողությամբ օգտագործվել ԴՆԹ-ի մոլեկուլները ներդնելու համար տարբեր տեսակի բջիջներ, ինչպիսիք են աճեցված կենդանական բջիջները, նախակենդանիները, խմորիչները, բակտերիաները և բույսերի պրոտոպլաստները: Երկշերտ լիպիդային մեմբրանի վրա բարձր լարման արտանետման էլեկտրածածկման ազդեցությունը, ըստ երևույթին, կախված է դրա կորության շառավղից: Հետևաբար, մանր բակտերիաների բջիջները արդյունավետորեն կլանում են ԴՆԹ-ն շատ ավելի մեծ դաշտի ուժով (10 կՎ/սմ կամ ավելի), քան կենդանիների և բույսերի խոշոր բջիջները, որոնք արդյունավետորեն կլանում են ԴՆԹ-ն 1-2 կՎ/սմ դաշտի ուժգնությամբ:

Էլեկտրոպորացիան ԴՆԹ-ի մոլեկուլները բջիջներ ներմուծելու ամենապարզ, ամենաարդյունավետ և վերարտադրվող մեթոդն է: Սակայն մինչ վերջերս այս մեթոդը կիրառվում էր սահմանափակ թվով լաբորատորիաներում՝ սերիական սարքերի՝ էլեկտրապորատորների բացակայության պատճառով։ Առաջիկա տարիներին նման սարքերի ի հայտ գալն ու կատարելագործումը կհանգեցնի այս մոտեցման լայն կիրառմանը բջիջների տեսակների լայն տեսականի գենետիկական ճարտարագիտության մեջ:

Բրինձ. 5. Էլեկտրոպորացիայի մեթոդ

«Մինի բջիջները» ստացվում են՝ արգելափակելով դոնորային բջիջները միտոզից կոլսեմիդով: Կոլսեմիդով բջիջների երկարատև բուժման դեպքում յուրաքանչյուր քրոմոսոմի շուրջ ձևավորվում է նոր միջուկային թաղանթ: Ցիտոխալազին B-ով բուժումը և ցենտրիֆուգացումը հանգեցնում են ցիտոպլազմային թաղանթում պարփակված միկրոմիջուկներ ներկայացնող մինի բջիջների ձևավորմանը:

Ստացված մինի բջիջները շատ զգայուն են տարբեր տեսակի ազդեցությունների նկատմամբ, ուստի միաձուլման համար ընտրվում են հատուկ մեղմ պայմաններ: Մեթոդը բարդ է, քմահաճ, ցածր արդյունավետություն՝ 10-6 - 10-7:

Լիպոսոմներում փաթեթավորումն օգտագործվում է էկզոգեն գենետիկական նյութը սահմանափակող ֆերմենտների կործանարար ազդեցությունից պաշտպանելու համար:

Լիպոսոմները գնդաձև թաղանթներ են, որոնք բաղկացած են ֆոսֆոլիպիդներից: Դրանք ստացվում են ջրային լուծույթի և լիպիդների խառնուրդը կտրուկ թափահարելով կամ ֆոսֆոլիպիդների ջրային էմուլսիաները ուլտրաձայնով մշակելով։ Ֆոսֆատիդիլսերինից և խոլեստերինից բաղկացած լիպոսոմները առավել հարմար են ԴՆԹ-ի ներթափանցման համար կենդանիների և բույսերի բջիջներում: Լիպոսոմների փոխանցման համակարգերը ցածր թունավորություն ունեն բջիջների համար:

Կենսաբանական բալիստիկ մեթոդը (բիոլիստիկա) այսօր բույսերի, հատկապես մոնոլիտների վերափոխման ամենաարդյունավետ մեթոդներից է։

Մեթոդի էությունն այն է, որ փոխակերպման համար անհրաժեշտ գենային կոնստրուկցիան պարունակող վեկտոր ԴՆԹ-ն ցողվում է 0,6-1,2 մկմ տրամագծով վոլֆրամի մանր մասնիկների վրա։ ԴՆԹ կրող վոլֆրամի մասնիկները կիրառվում են ցելոֆանային հիմքի վրա և տեղադրվում կենսաբանական ատրճանակի մեջ: Կալուսը կամ բջջային կախոցը կիրառվում է ագարային միջավայրով Պետրիի ափսեի վրա և տեղադրվում է կենսաբանական ատրճանակի տակ 10-15 սմ հեռավորության վրա: Հրացանի ճնշումը նվազեցվում է մինչև 0,1 ատմ, օգտագործելով վակուումային պոմպ: Ճնշման ազատման պահին վոլֆրամի մասնիկները հսկայական արագությամբ դուրս են մղվում կենսաբանական ատրճանակից և պատռելով բջջային պատերը՝ մտնում են բջիջների ցիտոպլազմա և միջուկ:

Սովորաբար, անմիջապես կենտրոնում տեղակայված բջիջները մահանում են վոլֆրամի մասնիկների հսկայական քանակի և ճնշման պատճառով, մինչդեռ ամենահաջող կերպով փոխակերպված բջիջները գտնվում են կենտրոնից 0,6-1 սմ հեռավորության վրա գտնվող գոտում: Այնուհետև բջիջները խնամքով տեղափոխվում են միջավայր՝ հետագա մշակման և վերականգնման համար:

Օգտագործելով կենսաբանական ատրճանակ՝ վերափոխվել են միաշերտ բույսեր, ինչպիսիք են եգիպտացորենը, բրինձը, ցորենը և գարին։ Այս դեպքում ստացվել են կայուն փոխակերպվող բույսեր։ Ի լրումն տրանսգենային մոնոլիտների ստացման հաջողության, կենսաբանական փոխակերպումն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի ուղղակիորեն սաղմնային ծաղկափոշու տեղափոխման և տրանսգենային դիհապլոիդ բույսերի հետագա արագ արտադրության համար, որոնք կարևոր քայլ են բուծման աշխատանքներում: Ներկայումս ծխախոտի բույսերի փոխակերպումն իրականացվում է այս մեթոդով և հապլոիդ բույսերի վերածնումից հետո ստացվել են կայուն տրանսֆորմատորներ։

2.3 Բջիջ գենի ուղղակի ներմուծման մեթոդներ

Ներկայումս E. coli բակտերիան բոլորից ամենաշատ ուսումնասիրված բջիջն է: Առավել լիովին ուսումնասիրված ֆագերի մեծ մասի համար ընդունող բջիջը նույնպես E. coli-ն է:

E. coli-ի պրոտոպլաստը պատված է արտաքին թաղանթին կից մուրեին պարկի մեջ: E. coli-ն վերաբերում է միկրոօրգանիզմներին, որոնք չունեն էկզոգեն ԴՆԹ-ի կլանման ֆիզիոլոգիական իրավասություն: Ուստի անհրաժեշտ է ստեղծել այնպիսի պայմաններ, որոնք թույլ կտան հաղթահարել բջջային պատի պատնեշը։ Նախ, սֆերոպլաստները ստացվում են իզոտոնիկ լուծույթում լիզոզիմով բջիջները մշակելով:

Գրամ-բացասական մանրէի արտաքին թաղանթի լիպոպոլիսախարիդային շերտը կայունացվում է երկվալենտ կատիոններով, ուստի կոմպլեքսավորող էթիլենդիամինտետրաքացախաթթուն (EDTA), որը կապում է երկվալենտ կատիոնները, օգտագործվում է E. coli-ի արտաքին թաղանթը թուլացնելու համար։ EDTA-ով բուժվելիս լիպոպոլիսաքարիդների մի մասը ազատվում է բջջի արտաքին թաղանթից, և լիզոզիմը կարող է հասնել մուրեյնի պարկի և հիդրոլիզացնել այն: Սա հանգեցնում է բջջային թաղանթի թափանցելիության բարձրացմանը: E. coli-ի սֆերոպլաստների ստացման և դրանց տրանսֆեկցիայի մեթոդների կատարելագործումը թույլ է տվել հասնել տարբեր ֆագերի ԴՆԹ մոլեկուլների փոխակերպման բավականին բարձր արդյունավետության:

Պարզվել է, որ վարակիչության վրա էականորեն ազդում է ֆագի ԴՆԹ մոլեկուլների ձևը, որը նրանք ընդունում են in vivo-ում: Շրջանաձև կամ գծային, բայց արագ փակվող ԴՆԹ-ով ֆագերը (լամբոիդ ֆագեր) բնութագրվում են տրանսֆեկցիոն ամենաբարձր արդյունավետությամբ։

E. coli-ի վրա իրականացված հաջող փորձերը խթան հանդիսացան նմանատիպ ուսումնասիրություններ անցկացնելու այլ պրոկարիոտ օրգանիզմների հետ: Ամենամեծ հաջողությունը հասել է Bacillus subtilis բջիջների հետ: B. subtilis-ը հողի ոչ ախտածին միկրոօրգանիզմ է, որն աճում է խիստ աերոբիկ պայմաններում: Բակիլները տոքսիններ չեն արտադրում և պաթոգեն չեն ոչ կենդանիների, ոչ մարդկանց համար, մինչդեռ E. coli-ի բջջային պատը պարունակում է էնդոտոքսին, որը բավականին դժվար է առանձնացնել գենետիկորեն մշակված արտադրանքներից: Բացի այդ, բացիլների բջջային պատն ունի պարզ կառուցվածք, և բակտերիաները կարող են բազմաթիվ սպիտակուցներ արտազատել կուլտուրայի հեղուկի մեջ: 20 տարբեր տեսակի բացիլներ արտաբջջային տեղայնացմամբ ավելի քան 40 ֆերմենտներ են արտազատում կուլտուրայի հեղուկի մեջ: E. coli-ն համեմատաբար քիչ սպիտակուցներ է արտազատում միջավայրում, և դրանց մեկուսացումն ու մաքրումը դժվար է: Պլազմիդներ և ֆագեր են հայտնաբերվել նաև բացիլներում, որոնք այժմ լավ ուսումնասիրված են։

Օտար գեները կլոնավորվում են այսպես կոչված մաքոքային վեկտորներում։ Այս վեկտորները նույն հաջողությամբ բազմանում են մի քանի հյուրընկալողների բջիջներում, այս դեպքում՝ E. coli և B. subtilis բջիջներում: Վեկտորները ստացվել են այս պլազմիդների բեկորների in vitro համադրությամբ:

E. coli գեներն իրենց կարգավորող շրջաններով չեն գործում B. subtilis-ում, ուստի օգտագործվել են B. subtilis-ի սեփական հոմոլոգ շրջանները:

Արտահայտվող գենը պարունակող ռեկոմբինանտ ԴՆԹ կառուցելու համար հետևում են հետևյալ ռազմավարությանը. cDNA-ն սինթեզվում է կամ գենոմի հատվածը ցանկալի գենով կրող բջիջները մեկուսացվում են կլոնային գրադարանից և կլոնավորվում համապատասխան վեկտորում: Գենոմային ԴՆԹ-ի բեկորները մոդիֆիկացված են՝ դրանցից հեռացվում են ոչ կոդավորող շրջանները և հարևան գեների հատվածները: Հաճախ այս գործողությունը պահանջում է այս ԴՆԹ-ի հատվածի հաջորդականությունը: Այնուհետև կառուցվում են միջանկյալ ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ներ, որոնցում գենը դրվում է բակտերիաների կարգավորիչ տարրերի (պրոմոտեր, օպերատոր, ռիբոսոմների կապման կետ) հսկողության տակ։ Այս կարգավորիչ տարրերը մեկուսացված են հիբրիդային պլազմիդներից, որոնք հատուկ նախագծված են որպես կարգավորող տարրերի աղբյուրներ: Ստացված կոնստրուկցիան տեղադրվում է համապատասխան վեկտորի մեջ, օրինակ՝ pBR 322, և գենը արտահայտվում է բակտերիալ բջիջում:

Այնուամենայնիվ, ավելի հարմար է գենը ինտեգրել հատուկ էքսպրեսիվ վեկտորի մեջ, որն արդեն պարունակում է կարգավորող տարրեր, որոնք ապահովում են ակտիվ էքսպրեսիան ռեկոմբինանտ պլազմիդի բակտերիաների բջիջ ներմուծելուց հետո։ Նման արդյունավետ կարգավորող շրջանները ներառում են, օրինակ, բետա-լակտամազ գենի ուժեղ խթանիչը (պենիցիլինի դիմադրության գեն, pBR 322 պլազմիդի մի մասը): Մի շարք գեներ, այդ թվում՝ ինսուլինի գենը, տեղադրվել են Pst I սահմանափակման տեղամասում, որը գտնվում է գենի կառուցվածքային մասում։ Այս գենի խթանողն ապահովում է արդյունավետ տրանսկրիպցիա, որը շարունակվում է այնքան ժամանակ, մինչև ՌՆԹ պոլիմերազը հասնի ներդրված գենի ավարտման ազդանշանին։

Վեկտորի նշագրման օրինակ է առաջին փորձերը E. coli-ի կամ ավելի ճիշտ նրա pBR322 պլազմիդներից մեկի հետ, որն իրականացվել է Գիլբերտի կողմից՝ ինսուլին արտադրելու համար: Պլազմիդ pBR322 պարունակում է 2 գեն, որոնք որոշում են դիմադրողականությունը ամպիցիլինի և տետրացիկլինի նկատմամբ։ PstI սահմանափակող ֆերմենտը կտրում է պլազմիդը գենի միջին մասում, որը կոդավորում է ապիցիլինի դիմադրության ֆերմենտը: Պլազմիդի ծայրերում տերմինալ տրանսֆերազի միջոցով տրոհվելուց հետո ավելացվել է չորս նուկլեոտիդների հաջորդականություն՝ գուանինի մնացորդներով: Այնուհետև, ինչպես միշտ, պրոինսուլինի գենը «կարել» են լիգազների միջոցով՝ ստանալով ռեկոմբինանտ ԴՆԹ: Պլազմիդի մեջ ինտեգրված ԴՆԹ-ի բեկորը խաթարել է ամպիցիլինը քայքայող ֆերմենտի սինթեզը, սակայն տետրացիկլինին դիմադրություն ապահովող գենը մնացել է ակտիվ։ Այս կերպ վերափոխված E. coli բջիջները սինթեզեցին հիբրիդային սպիտակուց, որը պարունակում է պենիցիլազ և պրոինսուլինի հաջորդականություն, ուստի կենսաբանորեն ակտիվ ինսուլին ստացվեց պենիցիլազայի և պրոինսուլինի միջին հատվածի կտրվածքով:

Մյուս կողմից, եթե օտար ԴՆԹ-ի բեկորը տեղադրվում է դիմադրողականության գեներից մեկի մեջ, ապա վերջինս ապաակտիվանում է։ Հետևաբար, այս գեներից մեկի մեջ օտար ԴՆԹ-ի բեկորի հաջող ինտեգրումը հեշտությամբ հայտնաբերվում է բակտերիաներում այս հակաբիոտիկի նկատմամբ դիմադրողականության անհետացման միջոցով:

2.4 Գենների ներմուծում կաթնասունների բջիջներում

Կաթնասունների բջիջներով մանիպուլյացիաները կարելի է բաժանել 2 մեծ խմբի՝ փորձեր սոմատիկ բջիջներով և փորձեր՝ սեռական բջիջների վերափոխման վերաբերյալ։ Վերջին դեպքում վերջնական արդյունքը տրանսգեն օրգանիզմների արտադրությունն է։

Կենդանական բջիջներում գեների փոխանցման վեկտորների բնութագրերը

Կենդանական բջիջ օտարերկրյա տեղեկատվություն ներմուծելու լավագույն կրիչներից մի քանիսը ռետրովիրուսների վրա հիմնված վեկտորներն են, օրինակ՝ մկների լեյկեմիայի վիրուսի հիման վրա: Նրանք ապահովում են բարձր արդյունավետ գեների փոխանցում և դրանց կայուն ինտեգրումը թիրախային բջիջների քրոմոսոմին: Հիմնականում կենդանական բջիջների փոխակերպումները կատարվում են կամ ռետրովիրուսների օգնությամբ (բոլոր փոխակերպումների մոտ 40%) կամ ԴՆԹ-ն լիպոսոմների մեջ փաթեթավորելու միջոցով (25%), ավելի քիչ հաճախ օգտագործվում են ադենովիրուսներ, քանի որ դրանք կարող են առաջացնել ուժեղ իմունային պատասխան, Բացի այդ, դրանց կրկնվող ներդրումն անհնար է:

Եթե ​​in vitro օտարերկրյա ԴՆԹ-ի առաքման խնդիրը գործնականում լուծված է, և դրա առաքումը տարբեր հյուսվածքների թիրախային բջիջներին in vivo հաջողությամբ լուծվել է (հիմնականում ստեղծելով ընկալիչի սպիտակուցներ կրող կոնստրուկցիաներ, ներառյալ որոշակի հյուսվածքներին հատուկ անտիգեններ), ապա մյուսները: գոյություն ունեցող վեկտորային համակարգերը` ինտեգրման կայունությունը, կարգավորվող արտահայտությունը, անվտանգությունը, դեռևս լուրջ բարելավումներ են պահանջում:

Սա առաջին հերթին վերաբերում է ինտեգրման կայունությանը։ Մինչ այժմ գենոմի մեջ ինտեգրումն իրականացվում էր միայն ռետրովիրուսային կամ ադենո ասոցացված վեկտորների միջոցով: Կայուն ինտեգրման արդյունավետությունը կարող է աճել՝ բարելավելով գենային կոնստրուկցիաները, ինչպիսիք են ընկալիչով միջնորդված համակարգերը, կամ ստեղծելով բավականաչափ կայուն էպիզոմային վեկտորներ (այսինքն՝ ԴՆԹ-ի կառուցվածքներ, որոնք կարող են երկարաժամկետ պահպանվել միջուկների ներսում):

Վերջերս հատուկ ուշադրություն է դարձվում կաթնասունների արհեստական ​​քրոմոսոմների (MAC) հիման վրա վեկտորների ստեղծմանը։ Սովորական քրոմոսոմների հիմնական կառուցվածքային տարրերի առկայության պատճառով նման մինի-քրոմոսոմները երկար ժամանակ պահվում են բջիջներում և ունակ են կրել լրիվ չափի (գենոմային) գեները և դրանց բնական կարգավորիչ տարրերը, որոնք անհրաժեշտ են ճիշտ աշխատանքի համար։ գենի, ճիշտ հյուսվածքի մեջ և ճիշտ ժամանակին: Նման արհեստական ​​քրոմոսոմներ արդեն ստեղծվել են խմորիչի համար (YAK), քանի որ խմորիչի գենոմը ամբողջությամբ քարտեզագրված է:

Փոփոխված բջիջները բացահայտելու համար անհրաժեշտ են մարկերներ: Եթե ​​սոմատիկ բջիջները փոխակերպվում են, սովորաբար օգտագործվում են սելեկտիվ մարկերներ: Ակսելը և Կոլումբիայի համալսարանի Բժշկության և վիրաբուժության քոլեջի գործընկերները այս կերպ շտկել են մկան բջիջների գենետիկական արատը: Նրանք վերցրեցին թիմիդին կինազի (TK) գեն պարունակող ԴՆԹ-ի մի հատված, որը ստացվում է հերպեսի վիրուսից, խառնեցին այս ԴՆԹ-ն սաղմոնի սերմնահեղուկի մի քանի միլիգրամ կրող ԴՆԹ-ի հետ և ԴՆԹ-ն ի պահ դրեցին մկների L-բջիջների կուլտուրայի վրա։ TK գենը բացակայում էր (TK-): 100000-ից 1 հաճախականությամբ բջիջները ձեռք են բերել TK գեն, հետևաբար, ընտրովի միջավայրի վրա, որը թույլ չի տալիս TK- բջիջներին աճել, TK+ բջիջները աճել և բազմապատկվել են նորմալ:

Մեկ այլ ընտրելի մարկեր՝ դիհիդրոֆոլատ ռեդուկտազը (DHFR) կոդավորող գենը կարող է օգտագործվել ոչ մուտանտ բջջային գծերի փոխակերպման համար: Արտահայտելով այս գենի բազմաթիվ օրինակներ՝ կենդանական բջիջը պլազմիդի հետ միասին դառնում է դիմացկուն ֆերմենտի ինհիբիտորի բարձր կոնցենտրացիաների նկատմամբ, և այդպիսով տրանսֆորմանտները կարող են ընտրվել արգելիչի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում։

Մշակվել են ևս երկու ունիվերսալ վեկտորներ, որոնք պարունակում են գենային մարկերներ, որոնք աշխատում են նորմալ բջիջներում: Դրանք կառուցված են նույն սկզբունքով. տրանսգենային բջիջների ֆենոտիպը որոշող պրոկարիոտ գեները կապված են էուկարիոտիկ կարգավորիչ ազդանշանների հետ։

Վեկտորներից մեկը բաղկացած է հակաբիոտիկ նեոմիցինի նկատմամբ դիմադրողականության պրոկարիոտ գենից, որը տեղադրված է SV-40 գենոմի վաղ շրջանում: Էուկարիոտիկ բջիջները զգայուն են նեոմիցինի անալոգային G 418-ի նկատմամբ, որն անակտիվացված է գենային արտադրանքի կողմից: Այսպիսով, փոխակերպված բջիջները ձեռք են բերում G 418 պարունակող միջավայրի վրա աճելու հատկություն։

2.5 Կաթնասունների սոմատիկ բջիջների գենետիկ փոխակերպում

Կաթնասունների փոխակերպված բջիջների կուլտուրաներն օգտագործվում են տարբեր նյութեր ստանալու համար։ Չնայած կենդանական բջիջների կուլտուրաները, հատկապես մեծ մասշտաբով աճեցնելու դեպքում, շատ ավելի քիչ տնտեսական են, քան բակտերիալ խմորիչ մշակույթները, նրանք ունեն զգալի առավելություն՝ սպիտակուցների՝ կաթնասունների գեների արտադրանքի փոքր, բայց շատ կարևոր փոփոխություններ կատարելու ունակություն: Օրինակ, մի շարք սպիտակուցների արդյունավետ գործելու համար անհրաժեշտ է դրանց կապել ածխաջրերի կամ լիպիդային մոլեկուլների շղթաներ։ Նման շղթաների ձևավորումն ու ամրացումը սովորական գործընթաց է կաթնասունների բջիջների համար, մինչդեռ բակտերիալ բջիջն ի վիճակի չէ նման փոփոխություններ կատարել:

Բացի արտադրող բջիջների ստեղծումից, կաթնասունների սոմատիկ բջիջների փոխակերպումը հնարավորություն է տալիս ուսումնասիրել գեների արտահայտման կարգավորման նուրբ մեխանիզմները և նպատակաուղղված ձևափոխել կենդանական բջիջների, իսկ անհրաժեշտության դեպքում՝ մարդկային բջիջների գենետիկական ապարատը, որը մեծ է: կարևորություն բժշկական գենետիկայի համար.

Կաթնասունների բջիջների կուլտուրաները կարող են արդյունավետ աղբյուր լինել որոշ վիրուսային անտիգենների մեկուսացման համար՝ կենդանիների և մարդկանց համար պատվաստանյութեր ստանալու նպատակով: Նման պատվաստանյութի բջիջների կուլտուրաների արտադրությունը հնարավոր է օգտագործելով ռեկոմբինանտ ԴՆԹ տեխնոլոգիան և արդյունավետ արտահայտման վեկտորները կաթնասունների և մարդու բջիջների համար: ԴՆԹ պատվաստանյութեր օգտագործելիս օրգանիզմ է ներմուծվում ոչ թե հակագեն, այլ այս անտիգենի սինթեզը կոդավորող գեն: Գենը մտցվում է պլազմիդի մեջ, իսկ պլազմիդն օրգանիզմ է ներմուծվում սովորական ներարկման միջոցով։

ԴՆԹ պատվաստանյութերը լավ հեռանկարներ ունեն անասնաբուծության ոլորտում: Մանրաթելը վիրուսային ծրարի սպիտակուց է: Մանրաթելային էպիտոպը կոդավորում է պաշտպանիչ հակամարմինների սինթեզը: Թռչունների հիվանդություններից մեկը՝ կրճատված ձվի արտադրության համախտանիշը (DEL), պայմանավորված է վիրուսով։ Այս վիրուսի ԴՆԹ-ի վերլուծությունից հետո մանրաթելը կոդավորող գենը մեկուսացվել է, կլոնավորվել և տեղադրվել պլազմիդի մեջ: Ռեկոմբինանտ պատվաստանյութը, երբ ներմուծվի օրգանիզմ, կբերի մանրաթելային ԴՆԹ բջիջ, վիրուսային սպիտակուցի արտադրությունը կհրահրի հատուկ հակամարմինների սինթեզ, այսինքն՝ կառաջացնի իմունային պատասխան:

Նման պատվաստանյութերի առավելությունը դրանց շատ փոքր ծավալն է՝ 10-50 մկգ պլազմիդը բավարար է մեկ մկան պատվաստման համար, 200-300 մկգ մեկ կովի համար։ Պլազմիդն օրգանիզմում մնում է մինչև 1 տարի։ ԴՆԹ պատվաստանյութերը միկոպլազմայի դեմ՝ տուբերկուլյոզի, սալմոնելոզի և լեյշմանիոզի հարուցիչ, ներկայումս գտնվում են կլինիկական փորձարկումների փուլում:

Օրգանիզմում չարորակ ուռուցքի զարգացումը սովորաբար ճնշում է իմունային համակարգը։ Խնդիրն այն է, որ ուժեղացվի իմունային համակարգը որպես ամբողջություն և ուղղորդվի դրա գործողությունը քաղցկեղի բջիջների դեմ: Էն Արբոր բժշկական դպրոցի (Միչիգան) գիտնականները գտել են քաղցկեղի դեմ պայքարի մեթոդ: Մկների մեկ այլ շտամի սպիտակուցներ կոդավորող գեները ներմուծվել են փորձարարական մկների հաստ աղիքի ուռուցքային բջիջներ: Դա կարելի է անել լիպոսոմների կամ վիրուսի միջոցով: Այն բանից հետո, երբ այս սպիտակուցները հայտնվեցին բջջային թաղանթի արտաքին մասում, իմունային համակարգը հարձակվեց այդպիսի բջիջների վրա: Հիվանդ մկների 20%-ն ապաքինվել է, 70%-ի մոտ ուռուցքը նվազել է, իսկ վերահսկիչ խմբում բոլորը մահացել են։ Լիմֆոցիտները պայքարում էին ոչ միայն «պիտակավորված» ուռուցքային բջիջների, այլև մետաստատիկ բջիջների դեմ, հետևաբար իմունային համակարգը «արթնացավ»։ Ներկայումս փորձարկումներ են իրականացվում մաշկի քաղցկեղով հիվանդ մարդկանց վրա:

2.6 Գենային թերապիա

Գեների միջոցով հիվանդությունների բուժումը կոչվում է գենային թերապիա: Այժմ աշխարհում կա մոտ 400 նախագիծ՝ նվիրված գենային թերապիայի միջոցով բուժմանը:

Գենային թերապիայի ծրագրի մշակմանը նախորդում է համապատասխան գենի հյուսվածքային արտահայտության մանրակրկիտ վերլուծությունը, առաջնային կենսաքիմիական թերության բացահայտումը, նրա սպիտակուցային արտադրանքի կառուցվածքի, ֆունկցիայի և ներբջջային բաշխման ուսումնասիրությունը, ինչպես նաև կենսաքիմիական անալիզը: պաթոլոգիական գործընթացի մասին. Այս բոլոր տվյալները հաշվի են առնվում համապատասխան բժշկական արձանագրություն կազմելիս։

Ժառանգական հիվանդության գենային ուղղման ընթացակարգի թեստավորումն իրականացվում է հիվանդի առաջնային բջիջների կուլտուրաների վրա, որոնցում այս գենը սովորաբար ֆունկցիոնալ ակտիվ է: Օգտագործելով այս բջջային մոդելները՝ գնահատվում է ընտրված էկզոգեն ԴՆԹ-ի փոխանցման համակարգի արդյունավետությունը, որոշվում է ներմուծված գենետիկական կառուցվածքի էքսպրեսիան, վերլուծվում է նրա փոխազդեցությունը բջջի գենոմի հետ և մշակվում են շտկման մեթոդներ կենսաքիմիական մակարդակում: Բջջային կուլտուրաների միջոցով հնարավոր է մշակել ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի նպատակային առաքման համակարգ, սակայն այս համակարգի գործողության հուսալիության ստուգումը կարող է իրականացվել միայն ամբողջ օրգանիզմի մակարդակով: Ուստի գենային թերապիայի ծրագրերում նման ուշադրություն է դարձվում կենդանիների համապատասխան ժառանգական հիվանդությունների բնական կամ արհեստականորեն ստացված մոդելների վրա in vivo փորձերին:

Նման կենդանիների գենետիկական արատների հաջող շտկումը և գենային թերապիայի անցանկալի կողմնակի ազդեցությունների բացակայությունը կլինիկական փորձարկումների հաստատման ամենակարևոր նախապայմանն են: Այսպիսով, ժառանգական արատի գենային ուղղման ստանդարտ սխեման ներառում է մի շարք հաջորդական փուլեր. Այն սկսվում է լիարժեք գործող (արտահայտված) գենետիկական կառուցվածքի ստեղծմամբ, որը պարունակում է գենի իմաստային (սպիտակուցային կոդավորում) և կարգավորող մասերը։ Հաջորդ փուլում լուծվում է վեկտորի խնդիրը՝ ապահովելով գենի արդյունավետ և, հնարավորության դեպքում, նպատակային առաքում թիրախ բջիջներին։ Այնուհետև իրականացվում է տրանսֆեկցիա (ստացված կոնստրուկցիայի տեղափոխում) թիրախ բջիջներ, տրանսֆեկցիայի արդյունավետությունը, առաջնային կենսաքիմիական թերության ուղղելիության աստիճանը բջիջների կուլտուրայի պայմաններում (in vitro) և, որ ամենակարևորն է, in vivo կենդանիների կենսաբանական մոդելներում: գնահատվել է. Միայն դրանից հետո կարող է սկսվել կլինիկական փորձարկման ծրագիրը։

Գոյություն ունի գենային թերապիայի երկու տեսակ՝ փոխարինող և ուղղիչ։

Գենային փոխարինող թերապիան ներառում է անձեռնմխելի գենի ներմուծում բջիջ: Ներկայացված պատճենը կփոխարինի հիվանդի գենոմում պահպանված արատավոր գենի ֆունկցիան։ Այսօր անցկացված բոլոր կլինիկական փորձարկումները ներառում են ԴՆԹ-ի լրացուցիչ քանակի ներմուծում բջիջ:

Ուղղիչ թերապիան ենթադրում է թերի գենի փոխարինում նորմալով` ռեկոմբինացիայի արդյունքում: Այս մեթոդը ներկայումս գտնվում է լաբորատոր փորձարկման փուլում, քանի որ դրա արդյունավետությունը դեռ շատ ցածր է։

Կախված հիվանդի գենոմում էկզոգեն ԴՆԹ-ի ներմուծման մեթոդից՝ գենային թերապիան կարող է իրականացվել կամ բջջային կուլտուրայում (ex vivo) կամ անմիջապես մարմնում (in vivo): Բջջային գենային թերապիան կամ ex vivo թերապիան ներառում է հիվանդի բջիջների հատուկ տեսակների մեկուսացում և մշակում, դրանց մեջ օտար գեների ներմուծում, տրանսֆեկցված բջիջների ընտրություն և դրանք նույն հիվանդի մեջ նորից ներարկում:

Օրինակ՝ համակցված իմունային անբավարարության բուժումը։ Համակցված իմունային անբավարարությունը կարող է առաջանալ ադենոզինդեամինազի գենի թերությունից: Նման հիվանդին գենային թերապիայի մեթոդներով բուժելու առաջին փորձը կատարվել է ԱՄՆ-ում 1990 թվականին: Հիվանդ երեխայից վերացվել են T-լիմֆոցիտները, փոխակերպվել ռետրովիրուսային վեկտորով, ներմուծվել է նորմալ ադենոզինդեամինազ գեն, և բջիջները վերադարձվել են մարմինը. Ներածությունը պետք է կրկնվի. Ոսկրածուծի ցողունային բջիջների նմանատիպ փոխակերպումն ավելի արդյունավետ է։

In vivo գենային թերապիան հիմնված է կլոնավորված և փաթեթավորված ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների ուղղակի ներդրման վրա հիվանդի կոնկրետ հյուսվածքներում: Ներկայումս թոքերի բջիջների մշակման համար հանրությանը հասանելի մեթոդ չկա, ուստի թոքերի հիվանդությունների դեպքում օտար գենը փոխանցելու միակ միջոցը այն ուղղակիորեն օրգանիզմ ներմուծելն է: Կիստիկական ֆիբրոզը շատ տարածված ծանր ժառանգական թոքերի հիվանդություն է սպիտակ ռասայի մարդկանց շրջանում, որն ազդում է, օրինակ, Կենտրոնական Եվրոպայի ընտանիքներում 2500-ից մեկ նորածնի մոտ և որի համար հայտնաբերվել է տրանսմեմբրանային հաղորդունակությունը կարգավորող սպիտակուցը կոդավորող թերի գեն: Թերի գենի հիմնական դրսեւորումը թոքաբորբն է։ Բոլոր էպիթելային բջիջները ազդում են: Հիմնական խնդիրն այն է, թե ինչպես փոխանցել գենը լորձով պատված բջիջներին, ինչը կանխում է փոխակերպումը: «Հիվանդության գենի» անձեռնմխելի պատճենը, որը ներառված է ադենովիրուսային վեկտորի կամ լիպոսոմի մեջ, ներարկվում է աերոզոլի տեսքով հիվանդի շնչառական տրակտում:

Դյուշենի պրոգրեսիվ մկանային դիստրոֆիայի խանգարումը շտկելու համար (տղաների հիվանդություն, որը կապված է X քրոմոսոմի արատների հետ), նրանք փորձեցին ուղղակիորեն ներարկել դիստրոֆիայի սպիտակուցը կոդավորող նորմալ գենը մկանային մանրաթելերի մեջ՝ օգտագործելով կամ «մերկ» ԴՆԹ կամ ադենովիրուսային վեկտոր։ . Այլ հետազոտողներ գենետիկ ուղղումից հետո հիվանդին միոբլաստներ են փոխպատվաստել: Նախկինում անշարժ երեխան ձեռք է բերել շարժվելու ունակություն։ Ցավոք, այս բոլոր փորձարկումներում հնարավոր է միայն ժամանակավոր թերապևտիկ էֆեկտ ստանալ, և գենի ներդրման կարգը պետք է կրկնել մի քանի անգամ։

Ժառանգական հիվանդությունների ցանկը, որոնք փորձարկվում կամ նախատեսվում է բուժել գեներով, երկար է։ Դրանք ներառում են ռևմատոիդ արթրիտ, ֆենիլկետոնուրիա և հիվանդություններ, որոնք կապված են հորմոնների պակասի հետ (ինսուլին, էրիտրոպոետին, աճի հորմոն): Էրիթրոպոետինի անբավարարության հետ կապված քրոնիկ սակավարյունության դեպքում, կենդանիների վրա կատարված փորձերի հիման վրա, առաջարկվում է բուժման սկզբունքորեն նոր մոտեցում: Քանի որ մեր բջիջներից յուրաքանչյուրը պարունակում է նույն գենոմը, հնարավոր է ստիպել մաշկի ֆիբրոբլաստներին, որոնք սովորաբար չէր արտադրում էրիտրոպոետին, սինթեզել այս հորմոնը: Դա անելու համար անհրաժեշտ է գենոմի մեջ ներմուծել նոր հսկողության շրջան և դրանով իսկ վերացնել ֆիբրոբլաստներում առկա, բայց «լուռ» erythropoietin գենի ընթերցման (արտահայտման) արգելքը:

Բժշկության գրեթե բոլոր բնագավառներում կա՛մ սկսվել են ժառանգական հիվանդությունների բուժման համար կլինիկական փորձարկումներ՝ օգտագործելով գենային թերապիա, կա՛մ մշակվում են նման բուժման մոտեցումներ կենդանիների փորձերում: Քանի որ բարելավվում են գեների փոխանցման և դրանց արտահայտման վերահսկման մեթոդները, անշուշտ կընդլայնվի այն հիվանդությունների ցանկը, որոնց նկատմամբ կարող է կիրառվել գենային թերապիա:

Քաղցկեղի բուժման համար գենային թերապիայի օգտագործումը հսկայական հեռանկարներ է բացում։ Գիտնականների երկար տարիների ջանքերը հանգեցրել են այն ըմբռնմանը, որ քաղցկեղը գենետիկ հիվանդություն է, և դրա զարգացումը տեղի է ունենում բազմաթիվ փուլերով՝ բջջում կուտակվող մի շարք գենետիկ խանգարումների արդյունքում։ Հետևաբար, այս անհատական ​​գենետիկ ազդեցություններից յուրաքանչյուրը կարող է թիրախ դառնալ գենային թերապիայի մոտեցման համար:

2.7 Տրանսգենային կենդանիների արտադրություն

Եթե ​​ԴՆԹ-ն ներմուծվի բազմաբջիջ օրգանիզմի բջիջներ, փոխակերպման արդյունքը կլինի միայն փոքր թվով բջիջների հատկությունների փոփոխություն, որոնք նոր գեն կամ գեներ են ձեռք բերել: Ուստի ամբողջ օրգանիզմի հատկությունները փոխելու համար պետք է փոխել սեռական բջիջների գենոմը, որը նոր հատկությունները կփոխանցի ժառանգներին։ Բույսերի և կենդանիների մոտ նպատակահարմար է փոխել այնպիսի հատկություններ, ինչպիսիք են աճի տեմպը, հիվանդությունների նկատմամբ դիմադրողականությունը և արտաքին նոր պայմաններին հարմարվելու ունակությունը: Որպես մարկեր այս դեպքում կարող են օգտագործվել սահմանափակող հատվածի երկարության պոլիմորֆիզմը (AFLP), մինիարբանյակային անալիզը, միկրոարբանյակային ԴՆԹ անալիզը (SSR), հիբրիդացումը և այլն։

Մեթոդներ են մշակվել կաթնասունների, ճանճերի և որոշ բույսերի սաղմնային բջիջներում գեների ներմուծման համար։ Բավականին մեծ երկկենցաղների ձվերի հետ աշխատելուց մենք անցանք մկան ձվերի և սաղմերի ուսումնասիրությանը, որը ներկայացնում է գենետիկորեն ամենաշատ ուսումնասիրված կաթնասունը:

Կլոնավորված գեների միկրոներարկումն իրականացվում է նոր բեղմնավորված մկան ձվի մեկ կամ երկու միջուկների մեջ: Ավելի հաճախ ընտրվում է սերմնահեղուկի կողմից ներմուծված արական պրոնուկլեուսը, քանի որ դրա չափերն ավելի մեծ են: Ներարկումից հետո ձվաբջիջը անմիջապես տեղադրվում է որդեգրած մոր ձվաբջջի մեջ կամ թույլ է տալիս մշակույթում զարգանալ մինչև բլաստոցիստական ​​փուլ, որից հետո այն տեղադրվում է արգանդի մեջ:

Դուք կարող եք սերմի մեջ գեն մտցնել, ապա նրանցով բեղմնավորում իրականացնել: Այսպիսով, ներարկվել են մարդու ինտերֆերոնի և ինսուլինի գեները, նապաստակի β-գլոբինի գենը, հերպեսի սիմպլեքս վիրուսի թիմիդին կինազի գենը և մկների լեյկոզ վիրուսի cDNA: Մեկ ներարկման ընթացքում կիրառվող մոլեկուլների թիվը տատանվում է 100-ից մինչև 300,000, իսկ դրանց չափը տատանվում է 5-ից 50 կբ: Սովորաբար ձվերի 10-30%-ը գոյատևում է, իսկ վերափոխված ձվերից ծնված մկների մասնաբաժինը տատանվում է մի քանիից մինչև 40%: Այսպիսով, փաստացի արդյունավետությունը կազմում է մոտ 10%:

Օտար գեների ինտեգրումը ոչ սպեցիֆիկ է քրոմոսոմների նկատմամբ, և օտար գենի կրկնօրինակների թիվը կարող է տատանվել մի քանիից մինչև 100 կամ ավելի: Այս գեները կազմում են տանդեմ կրկնությունների խումբ՝ միավորված գլխից պոչ ձևով: Ներարկումից հետո օտար ԴՆԹ հայտնաբերվել է ինչպես սոմատիկ, այնպես էլ սեռական բջիջներում: Սա նշանակում է, որ ինտեգրումը տեղի է ունենում զիգոտի զարգացման ամենավաղ փուլերում:

Մի քանի դեպքերում հետերոլոգ ԴՆԹ-ն ժառանգվել է մկների երեք սերունդների մեջ, ինչը ցույց է տալիս կայուն ինտեգրումը: Սեռական բջիջներում ինտեգրված ԴՆԹ-ն փոխանցվում է որպես Մենդելյան գեն: Հաստատվել է, որ օտար գենի արտահայտման մակարդակը կախված է քրոմոսոմների հետ ԴՆԹ-ի ինտեգրման վայրից և դրա մեթիլացման աստիճանից, ինչպես նաև հյուսվածքների տարբերակումից։ Որոշ դեպքերում հնարավոր է եղել ձեռք բերել հյուսվածքային հատուկ արտահայտություն: Կարևոր է նշել, որ հատուկ օտար գեներ կարող են տեղադրվել բջջի գենոմի մեջ այնպես, որ նրանք ենթարկվեն նորմալ կարգավորող ազդանշաններին:

1981 թվականին Կոնստանտինին և Լեյսին (Օքսֆորդ) նապաստակի քրոմոսոմային ԴՆԹ-ի 19 կիլոբազային բեկորներ ներարկեցին մկան ձվերի մեջ: Այս բեկորները պարունակում էին նապաստակի β-գլոբին գեն: Ձվերը մշակվել են մինչև բլաստոցիստի փուլ և տեղադրվել արգանդի մեջ: Իմպլանտացված ձվաբջիջների զարգացումից ծնված քսանչորս մկները մասնակի հեպատէկտոմիա են անցել: Լյարդի բջիջներից ԴՆԹ-ի վերլուծությունը ցույց է տվել, որ 9 մկների մոտ β-գլոբին գենի յուրաքանչյուր բջջի 1-ից 20 օրինակ կա: 4 վերափոխված արուները նորմալ էգերի հետ զուգավորվելուց հետո ստացվել են 18 կենդանիների սերունդ: Նրանցից 6-ի մոտ եղել է նաեւ β-գլոբինի գենը։ Հաստատվել է, որ գեների ինտեգրումը կաթնասունների բջիջներին պատահական է և կապված չէ քրոմոսոմի որոշակի շրջանների հետ: Գենը անկայուն է և կարող է կորչել կամ դառնալ անգործուն: Գենի հետ մեկտեղ պետք է ներմուծվեն կարգավորող հաջորդականություններ։

Սաղմնային բջիջներում գեների ներմուծման մեթոդը սահմանափակումներ ունի. Միշտ չէ, որ հնարավոր է օտար ԴՆԹ-ն ինտեգրել քրոմոսոմի տվյալ հատվածում: Մշակված մեթոդաբանական սկզբունքները դեռևս հնարավոր չեն դարձնում գենոմում գոյություն ունեցող գենը փոխարինելով այն, միշտ չէ, որ հնարավոր է նոր գենը ստորադասել մարմնի կարգավորիչ համակարգին.

Տրանսգենոզի ժամանակ կարող են առաջանալ անսպասելի խնդիրներ։ Օրինակ, կենդանիների գենետիկական վերափոխման վերաբերյալ առաջին աշխատանքներն իրականացվել են աճի հորմոնի գեների ներդրմամբ։ Առնետների աճի հորմոնի գենը մկներին փոխանցելը 2 անգամ ավելացրել է մկների աճը։ Հաջող են եղել նաև նապաստակների մեջ եղջերավոր կենդանիների աճի հորմոնի գեների տրանսգենոզի վերաբերյալ փորձերը: Սակայն խոշոր եղջերավոր անասունների փոփոխման վերաբերյալ նմանատիպ փորձերը հանգեցրել են աճի ընդամենը 10-20% աճի: Ակնհայտ է, որ դա պայմանավորված է նրանով, որ մկները պահպանում են ռեակցիայի լայն նորմ, և գեների ներդրումը, որոնք ավելացնում են հորմոնի քանակը, ստիպում են գենոտիպին հնարավորինս լիարժեք իրացնել: Անասնաբուծության մեջ ուղղորդված սելեկցիայի արդյունքում օրգանիզմները գործում են ռեակցիայի նորմայի վերին սահմանում, հետևաբար սպասվող ազդեցությունն իրեն չի դրսևորել։

Մեր երկրում սոմատոտրոպինի գենը կրող խոզեր են ստացվել։ Նրանք աճի տեմպերով չէին տարբերվում սովորական կենդանիներից, սակայն նյութափոխանակության փոփոխությունն ազդեց ճարպերի պարունակության վրա։ Նման կենդանիների մոտ լիպոգենեզի պրոցեսները արգելակվել են, իսկ սպիտակուցի սինթեզը ակտիվացել է։ Ինսուլինանման գործոնի գեների ներդրումը նույնպես հանգեցրեց նյութափոխանակության փոփոխությունների։ Նման տրանսգեն խոզերը ստեղծվել են հորմոնի կենսաքիմիական փոխակերպումների շղթան ուսումնասիրելու համար, իսկ կողմնակի ազդեցությունը եղել է իմունային համակարգի ամրապնդումը։

Սպիտակուցների սինթեզման ամենահզոր համակարգը գտնվում է կաթնագեղձի բջիջներում: Եթե ​​օտար սպիտակուցների գեները դնեք կազեին պրոմոտորի հսկողության տակ, ապա այդ գեների արտահայտությունը կլինի հզոր և կայուն, և սպիտակուցը կկուտակվի կաթում (կենդանիների ֆերմենտատոր): Արդեն արտադրվել են տրանսգենային կովեր, որոնց կաթը պարունակում է մարդու լակտոֆերին սպիտակուցը։ Այս սպիտակուցը նախատեսվում է օգտագործել ցածր իմունակայունություն ունեցող մարդկանց գաստրոէնտերոլոգիական հիվանդությունների կանխարգելման համար։ Սրանք ՁԻԱՀ-ով հիվանդներ են, վաղաժամ ծնված երեխաներ, քաղցկեղով հիվանդներ, ովքեր անցել են ռադիոթերապիա: Այս կաթի կլինիկական փորձարկումները շարունակվում են։ Genzyme Transgenics-ն արդեն ծրագրում է հետազոտություններ ստեղծել տրանսգենային խոշոր եղջերավոր կենդանիների, որոնք պարունակում են մարդկային ալբումին իրենց կաթում: Արտոնագիր է ձեռք բերվել շարակցական հյուսվածքի բջիջների (ֆիբրոբլաստների) գենոմ պարունակող սաղմերի ստացման համար, ներառյալ մարդու սպիտակուցի սինթեզի համար պատասխանատու գենը։ Այս տեխնոլոգիան հնարավորություն է տալիս բարձրացնել տրանսգենային կաթնատու կենդանիների ստեղծման արդյունավետությունը, քանի որ գեների սովորական ներարկումով բեղմնավորված ձվի մեջ ծնվում է փոխակերպված կենդանիների միայն 5-10%-ը, որոնցից մի քանիսը կաթ չեն արտադրում:

Կլոնավորման նոր տեխնոլոգիայի կիրառումը հնարավորություն է տալիս ձեռք բերել միայն տրանսգենային սպիտակուցներ արտադրող էգ կենդանիներ։ Ալբոմինը օգտագործվում է թերապիայի մեջ՝ արյան մեջ օսմոտիկ ճնշումը պահպանելու համար։ Ամեն տարի աշխարհում պահանջվում է մոտ 440 հազար լիտր արյան պլազմա՝ այս սպիտակուցը մեկուսացնելու համար (արժեքը մոտ $1,5 մլրդ)։ Յուրաքանչյուր կաթնատու կով կարող է տարեկան արտադրել 80 կգ ռեկոմբինանտ մարդկային ալբումին։ Genzyme Transgenics-ը նմանատիպ մեթոդներ է մշակում մարդու աճի հորմոնի և β-ինտերֆերոնի արտադրության համար:

Անգլիայում ստեղծվել են տրանսգենային ոչխարներ, որոնց կաթը պարունակում է արյան մակարդման գործոն։

Մեր երկրում փորձեր են արվել ստեղծել ոչխարներ, որոնք արտադրում են քիմոզին (պանրի պատրաստման ֆերմենտ): Ստացվել է 2 ոչխար, մեկում գենը չի արտահայտվել, երկրորդում՝ քիմոզինի պարունակությունը հասել է 300 մգ/լ-ի։ Սակայն այս ոչխարի սերունդը ցածր կաթնատվություն է տվել՝ լակտացիայի շրջանում մոտ 50 կգ։ Պատճառն այն էր, որ քիմոզինը արտադրվում է որպես պրեկուրսոր՝ պրոխիմոզին, որը pH=5-ում վերածվում է ակտիվ ֆերմենտի։ Նախատեսվում էր ստանալ պրոխիմոզին, սակայն կուրծքի որոշ հատվածներում նկատվում էր pH-ի նվազում, ինչը հանգեցրեց անմիջապես օրգանիզմում քիմոզինի ակտիվացմանը։ Ակտիվ քիմոզինով կաթնաշոռ կաթը, և այն խցանել է կուրծի ծորանները: Հիմա փորձում են լուծել այս խնդիրը։

Մոսկվայի մարզում նապաստակներ են ստացվել, որոնք արտազատում են γ-ինտերֆերոն և էրիթրոպոետին, սակայն ճագարները ավանդական կաթ արտադրող չեն։ Գյուղատնտեսական կենդանիների վերափոխման փորձերը շատ թանկ արժեն՝ մեկ տրանսգեն կենդանին արժե տասնյակ և հարյուր հազարավոր դոլարներ։

Տրանսգենային կենդանիներ են արտադրվում նաև քսենոտրանսպլանտացիայի նպատակով։ Օրգանների սիրելի դոնորներից մեկը խոզերն են, քանի որ օրգանների միջև կան անատոմիական նմանություններ և նմանատիպ իմունոլոգիական հատկություններ: Փոխպատվաստման ժամանակ մերժման ռեակցիաները բարդ մեխանիզմ ունեն. Օրգանիզմի օտար օրգանի վրա հարձակվելու ազդանշաններից մեկը մեմբրանի արտաքին մակերեսին տեղայնացված սպիտակուցներն են։ Տրանսգենային խոզերի մոտ այդ սպիտակուցները փոխարինվում են մարդկայինով:

Տրանսգենոզի մեկ այլ ուղղություն հիվանդություններին դիմացկուն կենդանիների արտադրությունն է։ Անասնաբուծությունը հիմնված է պատվաստանյութերի վրա, քանի որ ընտրությունը կատարվում է հիմնականում տնտեսապես արժեքավոր հատկանիշների համար՝ բրդոտություն, կաթնություն և այլն: Դիմադրողականության բարձրացումը գենետիկ ինժեների գործն է: Ինտերֆերոնները պաշտպանիչ սպիտակուցներ են, ուստի ինտերֆերոնի գենը տեղադրվել է տարբեր կենդանիների մեջ։ Տրանսգենային մկները դիմադրություն են ստացել, նրանք չեն հիվանդացել կամ քիչ են հիվանդացել, բայց խոզերի մոտ նման ազդեցություն չի հայտնաբերվել։

Մեկ այլ ուղղություն հակազգայական ՌՆԹ կոդավորող գեների ներմուծումն է։ Անասնաբուծության համար ՌՆԹ վիրուսներով առաջացած լեյկոզը սուր խնդիր է: Տրանսգենային նապաստակները, որոնք կրում են գեներ, որոնք պատասխանատու են բջջում հակազգայական ՌՆԹ-ի առկայության համար, դիմացկուն էին լեյկոզին:

Տրանսգենային կենդանիները կարող են օգտագործվել ուղեղի և նյարդային համակարգի ժառանգական հիվանդությունների ուսումնասիրության համար: Ալցհեյմերի հիվանդության գեները (β-ամիլոիդ սպիտակուցի նստվածքը հանգեցնում է բնորոշ թիթեղների ձևավորմանը) և էպիլեպսիայի և ուղեղի հիվանդությունների զարգացման համար պատասխանատու գեները ներմուծվում են նորմալ կենդանիների գենոմի մեջ. այս դեպքում ստացվում են տրանսգենային կենդանիների մոդելներ, որոնց վրա կարելի է փորձարկել տարբեր թերապևտիկ մեթոդներ:

Տրանսգենային կենդանիները օգտագործվել են մարդու բորբոքային և իմունոլոգիական հիվանդությունների ուսումնասիրության համար, ինչպիսին է ռևմատոիդ արթրիտը: Լիպիդային նյութափոխանակության հետ կապված հիվանդությունները մոդելավորվում են:

Եզրակացություն

Թեև գենետիկան և գենետիկական ճարտարագիտությունը արդեն իսկ հսկայական դեր են խաղում բժշկության և գյուղատնտեսության մեջ, սակայն հիմնական արդյունքները դեռ առջևում են: Մենք դեռ շատ բան ունենք սովորելու այն մասին, թե ինչպես են գործում բարդ գենետիկ համակարգերը մեր մարմնում և այլ տեսակների մեջ:

Պետք է որոշել յուրաքանչյուր գենի գործառույթներն ու նպատակը, որոշել, թե ինչ պայմաններ կան դրա ակտիվացման համար, կյանքի որ ժամանակահատվածներում, մարմնի որ մասերում և ինչ հանգամանքներում է այն միանում և հանգեցնում համապատասխան սպիտակուցի սինթեզին։ . Այնուհետև անհրաժեշտ է հասկանալ, թե ինչ դեր է խաղում այս սպիտակուցը մարմնում, արդյո՞ք այն դուրս է գալիս բջջի սահմաններից, ինչ հաղորդագրություններ է այն կրում, ինչ ռեակցիաներ է այն կատալիզացնում, ինչպես է այն ազդում մարմնի այլ մասերում կենսաբանական գործընթացների մեկնարկի վրա և ինչ: այն ակտիվացնում է գեները: Առանձին բարդ խնդիր է սպիտակուցի ծալման խնդիրը լուծելը՝ ինչպես, իմանալով սպիտակուցը կազմող ամինաթթուների հաջորդականությունը, որոշել դրա տարածական կառուցվածքն ու գործառույթները։ Այս խնդիրը պահանջում է նոր տեսական գիտելիքներ և ավելի հզոր սուպերհամակարգիչներ։

Սակայն գիտնականներին չի հուզում այս առաջադրանքի մասշտաբները: Մարդու գենոմի վերծանումը տևել է ավելի քան տասը տարի, սպիտակուցների ծալման խնդրի լուծումը կարող է մի փոքր ավելի երկար տևել, բայց երբ այն լուծվի, մարդը կկարողանա ամբողջությամբ վերահսկել կյանքի գործընթացները ցանկացած օրգանիզմի բոլոր մակարդակներում:

Հղումներ

1. Alberts B., Bray D., Lewis J. et al. T. 1 - 3. M.: Mir, 1994 թ.

2. Գենոմի վերլուծություն. Մեթոդներ / Էդ. Կ.Դևիս. M.: Mir, 1990. 246 p.

3. Աթանասով Ա. Կենսատեխնոլոգիան բուսաբուծության մեջ. Նովոսիբիրսկ: ICGSO RAS, 1993. – 241 p.

4. Բարանովով Վ.Ս. Գենային թերապիա – 21-րդ դարի բժշկություն // Սորոսի կրթական ամսագիր. No 3. 1999. P. 3 – 68:

5. Becker M.E., Liepins G.K., Raipulis E.P. Կենսատեխնոլոգիա. M.: Agropromizdat, 1990. 334 p.

6. Բորիսյուկ Ն.Վ. Սոմատիկ հիբրիդների մոլեկուլային գենետիկական կառուցվածքը // Կենսատեխնոլոգիա. Գիտության և տեխնիկայի արդյունքներ ՎԻՆԻՏԻ ԱՆ ՍՍՀՄ. M., 1988. T. 9. P. 73 -113.

7. Վալիխանովա Գ.Ժ. Բույսերի կենսատեխնոլոգիա. Ալմաթի: Կոնժիկ, 1996. 272 ​​էջ.

8. Gleba Yu.Yu. Բույսերի կենսատեխնոլոգիա // Սորոսի կրթական ամսագիր. No 6. 1998. P. 3 – 8:

9. Գլեբով Օ.Կ. Սոմատիկ բջիջների գենետիկական փոխակերպում // Բջջի մշակման մեթոդներ. Լ.: Նաուկա, 1988:

10. Goldman I.L., Razin S.V., Ernst L.K., Kadulin S.G., Grashchuk M.A. Տրանսգենային կենդանիների բջիջներում օտար գեների դիրքից անկախ արտահայտման խնդրի մոլեկուլային կենսաբանական ասպեկտները // Կենսատեխնոլոգիա. 1994. Թիվ 2:

11. Dyban A.P., Gorodetsky S.I. Օտար գեների ներմուծումը կաթնասունների գենոմում. ուղիներ և հեռանկարներ // Կենսատեխնոլոգիայի մոլեկուլային և բջջային ասպեկտները. L.: Nauka, 1986. էջ 82 - 97:

12. Եգորով Ն.Ս., Սամուիլով Վ.Դ. Միկրոօրգանիզմների արդյունաբերական շտամներ ստեղծելու ժամանակակից մեթոդներ // Կենսատեխնոլոգիա. Գիրք 2. Մ.: Բարձրագույն դպրոց, 1988. 208 էջ.

13. Զվերևա Ս.Դ., Ռոմանով Գ.Ա. Բույսերի գենետիկական ճարտարագիտության զեկուցող գեներ. բնութագրեր և փորձարկման մեթոդներ // Բույսերի ֆիզիոլոգիա. 2000. T. 47, No 3. P. 479-488.

14. Լեշչինսկայա Ի.Բ. Գենետիկական ճարտարագիտություն // Սորոսի կրթական ամսագիր. 1996. Թիվ 1. էջ 33 - 39։

15. Li A., Tinland B. T-DNA-ի ինտեգրումը բույսերի գենոմում. նախատիպ և իրականություն // Բույսերի ֆիզիոլոգիա. 2000, հատոր 47, թիվ 3. P. 354-359

16. Լուտովա Լ.Ա., Պրովորով Ն.Ա., Տիխոդեև Օ.Ն. և այլն: Բույսերի զարգացման գենետիկան: Սանկտ Պետերբուրգ: Nauka, 200. 539 p.

17. Lewin B. Genes. M.: Mir, 1987. 544 p.

18. Փիրուզյան Է.Ս., Անդրիանով Վ.Մ. Ագրոբակտերիաների պլազմիդներ և բույսերի գենետիկական ճարտարագիտություն Մ.: Nauka, 1985 թ.

19. Փիրուզյան Է.Ս. Բույսերի գենետիկական ճարտարագիտություն Մ.: Znanie, 1988. 64 p.

20. Փիրուզյան Է.Ս. Բույսերի գենետիկական ինժեներիայի հիմունքները: Nauka, 1988. 304 p.

21. Փիրուզյան Է.Ս. Օտար գեների արտահայտման խնդիրները բույսերում // Գիտության և տեխնիկայի արդյունքներ VINITI. Սեր. Կենսատեխնոլոգիա. 1990. T. 23. 176 p.

22. Պոպով Լ.Ս., Յազիկով Ա.Ա. Տրանսգենային կենդանիները որպես սաղմնային զարգացման և մարդու հիվանդությունների վերարտադրման մոդելներ // Առաջընթացներ ժամանակակից կենսաբանության մեջ: 1999 թ. T 119, No 1. P. 30-41.

23. Ռոմանով Գ.Ա. Բույսերի գենետիկական ճարտարագիտություն և կենսաանվտանգության խնդրի լուծման ուղիներ // Բույսերի ֆիզիոլոգիա, 2000 թ. հատոր 47, թիվ 3. էջ 343-353

24. Գյուղատնտեսական կենսատեխնոլոգիա. Դասագիրք. / Վ.Ս. Շևելուխա, Է.Ա. Կալաշնիկովա, Ս.Վ. Դեգտյարև և այլք: Էդ. Վ.Ս. Շևելուխի. Մ.: Ավելի բարձր: դպրոց, 1998. 416 էջ.

25. Singer M., Berg P. Գեներ և գենոմներ: T. 1-2. Մ.: Միր, 1998:

26. Տոմիլին Ն.Վ., Գլեբով Օ.Կ. Կաթնասունների բջիջների գենետիկ փոխակերպումը // Կենսատեխնոլոգիայի մոլեկուլային և բջջային ասպեկտները. L.: Nauka, 1986. էջ 62 - 82:

27. Ֆավորովա Օ.Օ. Գենետիկական բուժում՝ գեղարվեստական, թե իրականություն: // Սորոսի կրթական ամսագիր. No 2. 1997. էջ 21 – 27:

28. Շչելկունով Ս.Ն. Գենետիկական ճարտարագիտություն. Մաս 1. Նովոսիբիրսկ: Նովոսիբիրսկի համալսարանի հրատարակչություն, 1994 թ. 304 էջ.

Բջիջներում գեների ուղղակի ներմուծման մեթոդներ

Գենի ուղղակի ներմուծումը բջիջ իրականացվում է մի քանի եղանակով.

Տրանսֆեկցիա

Միկրոներարկում

Էլեկտրոպորացիա

Մինի բջջային մեթոդ

Փաթեթավորում լիպոսոմներում

Էլեկտրոնային ատրճանակ

ժամը տրանսֆեկցիաներԴՆԹ-ն ներծծվում է կալցիումի ֆոսֆատի բյուրեղների վրա (Graham Van der Eb, 1973): Ձևավորվում են կալցիումի նստվածքի մասնիկներ։ Բջջի կողմից դրանք ընդունվում են ֆագոցիտոզով։

Փոխակերպման արդյունավետությունը բարձրացնելու համար ԴՆԹ-ի ոչ սպեցիֆիկ կրիչն ավելացվում է հատուկ ԴՆԹ-ին, որը պարունակում է այն գենը, որի համար կկատարվի ընտրություն: Որպես կանոն, այդ նպատակով ԴՆԹ-ն վերցվում է հորթի տիմուսից կամ սաղմոնի սերմից: ԴՆԹ-ի մի մասը կապվում է թաղանթին և չի մտնում բջիջներ։ ԴՆԹ-ն ընդունվում է բջիջների 15-ից 90%-ի կողմից: Ընդունումից մի քանի օր անց բջիջների մի փոքր մասն ի վիճակի է արտահայտել օտար գեներ, բայց հետո արտահայտման մակարդակը նվազում է, և 10 -3 - 10 -5 բջիջները ենթարկվում են քիչ թե շատ կայուն փոխակերպման:

DEAE-dextran՝ պոլիմեր, որը կլանում է ԴՆԹ-ն, նույնպես օգտագործվում է տրանսֆեկցիայի համար։ Բջիջների մուտքի էֆեկտը և արտահայտման ժամանակը բարձր են, բայց կայուն փոխակերպման հաճախականությունը ավելի ցածր է, քան կալցիումի նստվածք օգտագործելիս: Տրանսֆեկցիայի հաճախականությունը մեծանում է գլիցերինային շոկի միջոցով (4 րոպե 15% գլիցերինի լուծույթում HEPES բուֆերում):

Ցանկացած գեն կարող է ներմուծվել բջիջներ, եթե այն նախկինում կապակցված է կլոնավորված ընտրվող մարկերով: Այնուամենայնիվ, հետագա ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ բջիջից դուրս կապելը անհրաժեշտ չէ: Բջիջները, որոնք կլանում են ընտրովի գենը, կլանում են նաև կալցիումի նստվածքում առկա այլ ԴՆԹ: Այսպիսով, օգտագործելով մեթոդը համատրանսֆորմացիաներԳրեթե ցանկացած կլոնավորված ԴՆԹ-ի հատված կարող է ներմուծվել աճեցված էուկարիոտ բջիջների մեջ, եթե այս ԴՆԹ-ն ներառվի խառնուրդի մեջ ընտրվող մարկերի հետ՝ կալցիումի նստվածք ձևավորելու համար:

Տրանսֆեկցիայի համար կարող են օգտագործվել քրոմոսոմներ կամ քրոմոսոմների բեկորներ: Դոնոր բջիջները արգելափակված են միտոզի փուլում: Միտոտիկ քրոմոսոմներն ազատվում են օսմոտիկ շոկի և միատարրացման ազդեցության տակ։ Դրանք մաքրվում են դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգմամբ: Քրոմոսոմները կալցիումի քլորիդով կուտակվում են բջիջների մակերեսին, և մի քանի ժամ հետո դրանք մշակվում են ռեագենտով, որը կարող է ծակել թաղանթները (օրինակ՝ գլիցերին):

Ստացող բջիջները մշակելու համար օգտագործվում են կոպիտ մաքրված քրոմոսոմային պատրաստուկներ, քանի որ քրոմոսոմները ամենաքիչն են ոչնչացվում: 1 բջիջ մշակելու համար քրոմոսոմների թիվը սահմանափակ է։ Ավելի լավ է օգտագործել ոչ ավելի, քան 20 քրոմոսոմ 1 ստացող բջջի համար, քանի որ կասեցման մեջ քրոմոսոմների բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում դրանք սոսնձվում են: Ստացող բջիջը պարունակում է դոնորային քրոմոսոմների բեկորներ, որոնք կարող են ինտեգրվել գենոմի մեջ և կարող են ինքնուրույն վերարտադրվել: Ներածված հատվածներում հաճախ նկատվում են ջնջումներ։

Ոչ բոլոր բջիջներն են ընդունակ փոխակերպելու գենոմային ԴՆԹ-ն բարձր հաճախականությամբ: Մարդու ֆիբրոբլաստները արդյունավետ կերպով ներառում են պլազմիդային ԴՆԹ և հազիվ են ներառում գենոմային ԴՆԹ:

ԴՆԹ միկրոներարկումկաթնասունների բջիջներում հնարավոր դարձավ 0,1-0,5 մկմ տրամագծով միկրոպիպետների և միկրոմանիպուլյատորի արտադրության սարքի հայտնվելով (նկ. 45): Այսպիսով, հերպեսի վիրուսի բեկոր պարունակող պլազմիդներ՝ թիմիդին կինազա (TK) գենով և պլազմիդ pBR322, ներարկվել են TK- բջիջներ և ցույց են տվել, որ TK- գենը ներթափանցել է միջուկներ և նորմալ վերարտադրվել դրանցում: ԴՆԹ-ի ներմուծման մեթոդը միկրոներարկման միջոցով մշակվել է 70-ականների սկզբին Անդերսոնի և Դիակումակոսի կողմից: Սկզբունքորեն լավ սարքավորումների դեպքում 1 ժամում կարելի է ներարկել 500-1000 բջիջ, իսկ լավագույն փորձերի ժամանակ բջիջների 50%-ում նկատվում է ներարկվող գեների կայուն ինտեգրում և արտահայտում։ Նկարագրված մեթոդի առավելությունը նաև այն է, որ այն թույլ է տալիս ցանկացած ԴՆԹ ներմուծել ցանկացած բջիջ, և բջիջներում ներմուծված գենը պահպանելու համար ընտրովի ճնշում չի պահանջվում։

Բրինձ. 45. ԴՆԹ-ի ներմուծում միկրոներարկումով

Էլեկտրոպորացիահիմնված է այն փաստի վրա, որ բարձր լարման իմպուլսները շրջելիորեն մեծացնում են կենսամեմբրանների թափանցելիությունը։ Բջիջները և ԴՆԹ-ի բեկորները, որոնք պետք է ներմուծվեն բջիջների մեջ, ավելացվում են էլեկտրապորացիայի միջավայրին (նկ. 46): Բարձր լարման իմպուլսները (լարումը 200 - 350 Վ, իմպուլսի տևողությունը 54 մվ) անցնում են միջավայրով, ինչը հանգեցնում է ցիտոպլազմիկ թաղանթում ծակոտիների առաջացման (էլեկտրական քայքայում), որոնց կյանքի տևողությունը և չափը բավարար են այնպիսի մակրոմոլեկուլների համար, ինչպիսիք են ԴՆԹ-ն։ օսմոտիկ ուժերի գործողության արդյունքում արտաքին միջավայրից բջիջ մտնել. Միաժամանակ մեծանում է բջջի ծավալը։

Էլեկտրական դաշտի ուժգնությունը և դրա գործողության տևողությունը, փոխակերպվող ԴՆԹ-ի և ստացող բջիջների կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր բջջային համակարգի համար ընտրվում են փորձարարական եղանակով՝ գոյատևած բջիջների կողմից ԴՆԹ-ի կլանման բարձր տոկոսի հասնելու համար: Ցույց է տրվել, որ էլեկտրապորացիայի օպտիմալ պայմաններում փոխակերպիչների թիվը կարող է հասնել գոյատևած բջիջների 80%-ին:

Էլեկտրոպորացիան ֆիզիկական, այլ ոչ թե կենսաքիմիական մեթոդ է, և, ըստ երևույթին, դա է պատճառը, որ այն լայնորեն կիրառվում է: Բազմաթիվ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ էլեկտրոպորացիան կարող է հաջողությամբ օգտագործվել ԴՆԹ-ի մոլեկուլները ներդնելու համար տարբեր տեսակի բջիջներ, ինչպիսիք են աճեցված կենդանական բջիջները, նախակենդանիները, խմորիչները, բակտերիաները և բույսերի պրոտոպլաստները: Երկշերտ լիպիդային մեմբրանի վրա բարձր լարման արտանետման էլեկտրածածկման ազդեցությունը, ըստ երևույթին, կախված է դրա կորության շառավղից: Հետևաբար, մանր բակտերիաների բջիջները արդյունավետորեն կլանում են ԴՆԹ-ն շատ ավելի մեծ դաշտի ուժով (10 կՎ/սմ կամ ավելի), քան կենդանիների և բույսերի խոշոր բջիջները, որոնք արդյունավետորեն կլանում են ԴՆԹ-ն 1-2 կՎ/սմ դաշտի ուժգնությամբ:

Էլեկտրոպորացիան ԴՆԹ-ի մոլեկուլները բջիջներ ներմուծելու ամենապարզ, ամենաարդյունավետ և վերարտադրվող մեթոդն է: Սակայն մինչ վերջերս այս մեթոդը կիրառվում էր սահմանափակ թվով լաբորատորիաներում՝ սերիական սարքերի՝ էլեկտրապորատորների բացակայության պատճառով։ Առաջիկա տարիներին նման սարքերի ի հայտ գալն ու կատարելագործումը կհանգեցնի այս մոտեցման լայն կիրառմանը բջիջների տեսակների լայն տեսականի գենետիկական ճարտարագիտության մեջ:

Բրինձ. 46. ​​Էլեկտրոպորացիայի մեթոդ

«Մինի բջիջներ»ստացված դոնորային բջիջները միտոզում կոլսեմիդով արգելափակելու միջոցով: Կոլսեմիդով բջիջների երկարատև բուժման դեպքում յուրաքանչյուր քրոմոսոմի շուրջ ձևավորվում է նոր միջուկային թաղանթ: Ցիտոխալազին B-ով բուժումը և ցենտրիֆուգացումը հանգեցնում են ցիտոպլազմային թաղանթում պարփակված միկրոմիջուկներ ներկայացնող մինի բջիջների ձևավորմանը:

Ստացված մինի բջիջները շատ զգայուն են տարբեր տեսակի ազդեցությունների նկատմամբ, ուստի միաձուլման համար ընտրվում են հատուկ մեղմ պայմաններ: Մեթոդը բարդ է, քմահաճ, ցածր արդյունավետություն՝ 10 -6 - 10 -7։

Փաթեթավորում լիպոսոմներումօգտագործվում է էկզոգեն գենետիկական նյութը սահմանափակող ֆերմենտների կործանարար ազդեցությունից պաշտպանելու համար:

Լիպոսոմները գնդաձև թաղանթներ են, որոնք բաղկացած են ֆոսֆոլիպիդներից: Դրանք ստացվում են ջրային լուծույթի և լիպիդների խառնուրդը կտրուկ թափահարելով կամ ֆոսֆոլիպիդների ջրային էմուլսիաները ուլտրաձայնով մշակելով։ Ֆոսֆատիդիլսերինից և խոլեստերինից բաղկացած լիպոսոմները առավել հարմար են ԴՆԹ-ի ներթափանցման համար կենդանիների և բույսերի բջիջներում: Լիպոսոմների փոխանցման համակարգերը ցածր թունավորություն ունեն բջիջների համար:

Կենսաբանական բալիստիկ մեթոդ (կենսաբանություն)այսօր բույսերի վերափոխման ամենաարդյունավետ մեթոդներից մեկն է, հատկապես՝ միասոտին:

Մեթոդի էությունն այն է, որ փոխակերպման համար անհրաժեշտ գենային կոնստրուկցիան պարունակող վեկտոր ԴՆԹ-ն ցողվում է 0,6-1,2 մկմ տրամագծով վոլֆրամի մանր մասնիկների վրա։ ԴՆԹ կրող վոլֆրամի մասնիկները կիրառվում են ցելոֆանային հիմքի վրա և տեղադրվում կենսաբանական ատրճանակի մեջ: Կալուսը կամ բջջային կախոցը կիրառվում է ագարային միջավայրով Պետրիի ափսեի վրա և տեղադրվում է կենսաբանական ատրճանակի տակ 10-15 սմ հեռավորության վրա: Հրացանի ճնշումը նվազեցվում է մինչև 0,1 ատմ, օգտագործելով վակուումային պոմպ: Ճնշման ազատման պահին վոլֆրամի մասնիկները հսկայական արագությամբ դուրս են մղվում կենսաբանական ատրճանակից և պատռելով բջջային պատերը՝ մտնում են բջիջների ցիտոպլազմա և միջուկ:

Սովորաբար, անմիջապես կենտրոնում տեղակայված բջիջները մահանում են վոլֆրամի մասնիկների հսկայական քանակի և ճնշման պատճառով, մինչդեռ ամենահաջող կերպով փոխակերպված բջիջները գտնվում են կենտրոնից 0,6-1 սմ հեռավորության վրա գտնվող գոտում: Այնուհետև բջիջները խնամքով տեղափոխվում են միջավայր՝ հետագա մշակման և վերականգնման համար:

Օգտագործելով կենսաբանական ատրճանակ՝ վերափոխվել են միաշերտ բույսեր, ինչպիսիք են եգիպտացորենը, բրինձը, ցորենը և գարին։ Այս դեպքում ստացվել են կայուն փոխակերպվող բույսեր։ Ի լրումն տրանսգենային մոնոլիտների ստացման հաջողության, կենսաբանական փոխակերպումն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի ուղղակիորեն սաղմնային ծաղկափոշու տեղափոխման և տրանսգենային դիհապլոիդ բույսերի հետագա արագ արտադրության համար, որոնք կարևոր քայլ են բուծման աշխատանքներում: Ներկայումս ծխախոտի բույսերի փոխակերպումն իրականացվում է այս մեթոդով և հապլոիդ բույսերի վերածնումից հետո ստացվել են կայուն տրանսֆորմատորներ։

Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն ներմուծվում է ստացող բջիջներում: Գենային ճարտարագիտության մեջ նման ստացող բջիջները երկու դեր են խաղում. 1. Նրանք թույլ են տալիս գենային բանկում փնտրել սինթեզված ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի կլոններ։ 2 Հետագայում նման ստացող բջիջները կարող են օգտագործվել թիրախային արտադրանքներ ստանալու համար:

Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ներդրման մեթոդը հաշվի է առնվում՝ ելնելով վեկտորի տեսակից, որը ստացվել է նման ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն, և որ օրգանիզմների բջիջներում այն ​​պետք է ներմուծվի բջիջը կամ պրոտոպլաստը փոխակերպելով կամ օգտագործելով էլեկտրապորացիայի մեթոդը: Եթե ​​ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն ստացվում է ֆագերից, այն կարող է ներմուծվել մեկուսացված ԴՆԹ՝ սա տրանսվեկցիա է: Դուք կարող եք ներմուծել անձեռնմխելի ֆագային մասնիկներ. սա վարակ է (կոսմիդներ, ֆազմիդներ):

Դոկտ. գենետիկական փոխանակման մեթոդներ՝ կոնյուգացիա, փոխարկում:

Բուսական բջիջներում՝ բույսերի պրոտոպլաստների փոխակերպում, բույսերի բջիջների կամ հյուսվածքների վերամշակում ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ով; լայնորեն կիրառվում է միջուկի մեջ ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ներարկումը. լիպոսոմների օգտագործումը. Լիպոսոմները գնդաձեւ կառուցվածքներ են, որոնք ունեն լիպիդային թաղանթ, որի ներսում կա ռեկոմբինանտ ԴՆԹ։ Կենդանական բջիջների մեջ ներմուծման համար՝ վիրուսային վարակներ, էլեկտրոպորացիայի մեթոդ, միկրոներարկում միջուկի մեջ: Եթե ​​ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ներմուծումից հետո այն ժառանգում են օրգանիզմի բոլոր բջիջները, ապա խոսում են տրանսգեն օրգանիզմ ստանալու մասին։

Էլեկտրոպորացիա - բջիջները կամ պրոտոպլաստը կարճ ժամանակով ենթարկվում են բարձր լարման հոսանքի (2000-4000 վոլտ): Արդյունքում, բջջային թաղանթում առաջանում են մոտ. 30 նմ, որը կարող է գոյություն ունենալ 1-2 րոպե և որի միջոցով ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն կարող է ներթափանցել բջիջ։ Այնուհետև ծակոտիները փակվում են, և ԴՆԹ-ն մնում է խցում: Սա ունիվերսալ մեթոդ է։

Բալիստիկ մեթոդ- օգտագործվում են հիմնականում էուկարիոտների մեջ: Օգտագործվում են բալիստիկ հրացաններ, որոնց մեջ ներմուծվում են AK կամ W մասնիկներ, որոնց վրա ցողվում է ռեկոմբինանտ ԴՆԹ։ Այնուհետև P-ի իներտ գազերի օգնությամբ նման մասնիկներ հրացանից կրակում են բջիջների կուլտուրա։ Ըստ տարբեր օրինաչափությունների՝ մասնիկների մի մասը մտնում է միջուկ և այնտեղ պահպանվում է ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն։

Որոնեք ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ով կլոններ:

Այս փուլը բարդ է և անկանխատեսելի։

Ամենապարզ մեթոդը կլոնների որոնումն է ըստ ֆենոտիպի՝ ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ներդրումից հետո(օրինակ՝ պիգմենտացիա): Դուք կարող եք օգտագործել լրացման թեստեր, բայց անհրաժեշտ է ունենալ մուտանտ բջիջներ, որոնք թերի են ակտիվ արտադրանքի սինթեզում:

Հիբրիդացման մեթոդները պահանջում են հատուկ պիտակավորված ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի զոնդերի առկայությունը: Ավելի հաճախ դրանք պիտակավորված են P 32: Զոնդերը մ.բ. կարճ օլիգոնուկլեոտիդային հաջորդականություններ, որոնք համապատասխանում են որոնվող գենի առավել պահպանված մասին: Այս պահպանված հաջորդականությունները կարող են ներառել մինչև 100 նուկլեոտիդ պրոկարիոտների և մինչև 1000 նուկլեոտիդների համար՝ էուկարիոտների համար։

Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ներմուծումից հետո միջավայրի վրա ձևավորված գաղութները տեղափոխվում են հատուկ նիտրոցելյուլոզային ֆիլտր: Նրանք ենթարկվում են լիզի և ԴՆԹ-ի հետագա դենատուրացիայի՝ օգտագործելով ալկալիներ: ԴՆԹ-ն սերտորեն կապվում է ֆիլտրին: Զտիչը լվանում և մշակվում է ռադիոակտիվ պիտակավորված զոնդով, և որոշվում է կլոնը, որին կապվել է այս զոնդը:

Իմունաքիմիական մեթոդներ - ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ներդրումից հետո կլոնները լիզվում են և բուժվում են համապատասխան արտադրանքի հակամարմիններով: Նման հակամարմինները պիտակավորված են:

Չանգ Լուն Վիրջինիա Tech-ի քիմիական ճարտարագիտության ասիստենտ է: (Լուսանկարը՝ Virginia Tech)

Վիրջինիայի տեխնիկական համալսարանի քիմիական ճարտարագիտության ամբիոնի ասիստենտ ( Վիրջինիայի տեխՉանգ Լուն և քիմիական ինժեներների նրա հետազոտական ​​թիմը պարզել են, թե ինչպես «էականորեն բարելավել» գենետիկական նյութի առաքումը բջիջներ. ԴՆԹ. Նրանց աշխատանքը նկարագրող թուղթ տպագրվել է առաջատար միկրոֆլյուիդիկայի ամսագրում: Լաբորատորիա չիպի վրա, ինչպես նաև ներս Բնություն .

Դոկտոր Լուի վերջնական նպատակն է կիրառել իրենց մշակած մեթոդը՝ քաղցկեղի իմունոթերապիայի, բուժման համար գենետիկորեն ձևափոխված բջիջներ ստեղծելու համար։ ցողունային բջիջներև հյուսվածքների վերականգնում:

Բջիջներ գեներ փոխանցելու ամենալայն կիրառվող ֆիզիկական մեթոդներից մեկը «անհավանականորեն անարդյունավետ է, քանի որ թաղանթի ընդհանուր մակերեսի միայն մի փոքր մասն է թափանցելի», - ասաց դոկտոր Լուն:

Այն մեթոդը, որին դիմել է Լուն, կոչվում է էլեկտրոպորացիա, որն անվանվել է տասնամյակներ շարունակ հայտնի երևույթի պատճառով, որը մեծացնում է բջիջների թափանցելիությունը դրանց վրա էլեկտրական դաշտի կիրառման արդյունքում՝ հանգեցնելով դրանց թաղանթում մանր ծակոտիների ձևավորմանը։

Դոկտոր Լուն բացատրում է էլեկտրապորացիայի մեթոդի գործողության մեխանիզմը, որն ինքն ու իր գործընկերները կատարելագործել են այսպես. «Սովորական էլեկտրոպորացիայի մեթոդները ԴՆԹ են փոխանցում միայն բջջի մակերեսի շատ սահմանափակ հատվածով, որը որոշվում է էլեկտրական դաշտի և էլեկտրական դաշտի փոխազդեցությունը կարգավորող ֆիզիկական երևույթներով։ բջիջը։ Մեր մեթոդը թույլ է տալիս հասնել ԴՆԹ-ի միատեսակ առաքում ամբողջ բջջի մակերևույթով, ինչը, մեր գիտելիքներով, ցուցադրվել է առաջին անգամ: Արդյունքը գենետիկական նյութի փոխանցման հսկայական աճ է»։

Նոր մոտեցումը օգտագործում է «հիդրոդինամիկական էֆեկտներ, որոնք տեղի են ունենում միայն այն ժամանակ, երբ հեղուկի հոսքերը շարժվում են կոր ալիքներով: Հայտնի է, որ նման պայմաններում հոսքը հորձանուտներ է կազմում։ Նման հոսքով տեղափոխվող բջիջները պտտվում են, և դրանց մակերեսի մեծ մասը ենթարկվում է էլեկտրական դաշտին»։ Գենի առաքումը կոր ալիքներում հոսքերի օգտագործմամբ զգալի առավելություններ ունի ստատիկ լուծույթներում և ուղիղ ալիքներում ավանդաբար օգտագործվող էլեկտրապորացիայի նկատմամբ:

«Պիրալային ալիքը կրկնակի աճ է տալիս ուղիղ կապուղու համեմատ և նույնիսկ ավելի մեծ՝ համեմատած ստատիկ լուծման հետ», - բացատրում է գիտնականը:

Օգտագործելով ֆլուորեսցենտային մանրադիտակ՝ գիտնականները կարողացել են «քարտեզագրել» բջջի մակերեսի վրա գտնվող էլեկտրածակված տարածքները և որոշել ԴՆԹ-ի մուտքի չափը դրան։

Լուսանկարը Լաբորատորիայից Chip կայքում

Պայմանական ԴՆԹ-ի առաքումը կուվետային տիպի սարքերի միջոցով ստատիկ բջջային կասեցումով կատարվում է միայն բջջի մակերեսի նեղ շերտում: Եթե ​​էլեկտրոպորացիան իրականացվում է պարուրաձև կամ կոր ալիքով լողացող բջիջների վրա, պատկերները զգալիորեն տարբերվում են՝ ցույց տալով ԴՆԹ-ի փոխանցման հավասարաչափ բաշխում բջջի ողջ մակերեսով:

Տեխնիկան, որը մշակվել է Կալիֆորնիայի Իրվինի համալսարանի գիտնականների կողմից՝ դոկտոր Փիթեր Դոնովանի ղեկավարությամբ և հիմնված է սաղմնային ցողունային բջիջների մանիպուլյացիայի երկու հայտնի մեթոդների վրա, կրկնապատկում է մարդու սաղմնային ցողունային բջիջներին ԴՆԹ-ի առաքման արդյունավետությունը:

ԴՆԹ-ի ներդրման ժամանակակից մեթոդները hESC-ներում՝ օգտագործելով քիմիական տրանսֆեկցիան, նուկլեֆեկցիան և էլեկտրոպորացիան, ունեն լուրջ թերություն՝ ցածր արդյունավետություն: Վիրուսային վարակի միջոցով գենետիկական նյութի առաքումը hESC-ներին ավելի արդյունավետ է, բայց ունի բազմաթիվ անցանկալի հետևանքներ ցողունային բջիջների համար և չի կարելի բժշկական տեսանկյունից լիովին անվտանգ անվանել, եթե բջիջները նախատեսված են հետագա փոխպատվաստման համար:

Նոր տեխնիկան, որը հիմնված է մեկ ցողունային բջջի նուկլեֆեկցիայի համակցության և արդյունքում ստացվող տրանսգենային գաղութների ընտրության օպտիմալացված մեթոդի վրա, ապահովում է տրանսգենների ժամանակին և կայուն արտահայտումը բջիջներում: Nucleofection-ը ներառում է բջջային թաղանթում ծակոտիների ձևավորում՝ օգտագործելով էլեկտրական իմպուլսներ և հետագայում ԴՆԹ-ի ներմուծումը բջիջ:

Բացի հետաքրքրող գենից, փոփոխվող ԴՆԹ-ի կոնստրուկցիան կրում է մի գեն, որը թույլ է տալիս հեշտությամբ հետևել վերափոխված բջիջին, օրինակ՝ ռենիլա կանաչ ֆլուորեսցենտային սպիտակուցը (hrGFP) կոդավորող գենը: Բջիջների պիտակավորման այս մեթոդը հնարավորություն է տալիս դիտարկել փոխակերպված բջիջների շարժումը, երբ դրանք փոխպատվաստվում են կենդանիների:

Պոտենցիալ կերպով, այս մեթոդը կարող է օգտակար լինել հիվանդ մարդու բոլոր բջիջներում մեկ գենի մուտացիաների հետևանքով առաջացած մոնոգեն հիվանդությունների բուժման համար: Առողջապահության համաշխարհային կազմակերպության տվյալներով՝ մարդու ավելի քան 10000 հիվանդություններ մոնոգեն բնույթ ունեն։ Աշխարհում միլիոնավոր մարդիկ տառապում են մոնոգեն հիվանդություններից, որոնք ներառում են Հանթինգթոնի հիվանդությունը, մանգաղ բջջային անեմիան, հեմոֆիլիան և կիստիկական ֆիբրոզը:

Նոր մեթոդը կընդլայնի hES բջիջների մանիպուլյացիայի հնարավորությունները՝ հնարավորություն տալով մոդելավորել մարդկանց հիվանդությունները և գտնել համապատասխան դեղամիջոցներ։ Օգտագործելով այս տեխնիկան՝ գիտնականները կկարողանան շտկել ցողունային բջիջներում առկա գենետիկական խանգարումները և օգտագործել առողջ բջիջները վերականգնողական բժշկության մեջ:

hES բջիջների գաղութ, որոնք արտահայտում են կանաչ լյումինեսցենտ սպիտակուցներ hrGFP.

Հոդված Հոհենշտեյն Ք.Ա. և այլք. «Nucleofection-ը միջնորդում է բարձր արդյունավետության կայուն գենի անկումը և տրանսգենային արտահայտումը մարդու սաղմնային ցողունային բջիջներում» հասանելի է ամսագրի առցանց տարբերակում: Ցողունային բջիջներ 2008 թվականի մարտի 6-ից։