Cultura mista de linfócitos in vitro. O que é SCL? No CIR você pode fazer o teste de SCL
SCL - cultura mista de linfócitos
MLC - cultura mista de linfócitos
Este teste consiste em um conjunto de culturas que determinam até que ponto os cônjuges reconhecem os antígenos de histocompatibilidade um do outro.
Linfócito - célula central sistema imunológico. O sistema linfocitário pode ser comparado a um estado, onde existem superiores e subordinados, e cada funcionário desempenha uma função especializada.
Se um linfócito encontrar quaisquer objetos estranhos ao corpo (bactérias, vírus, células estranhas, etc.), uma resposta imunológica se desenvolverá. Se estamos falando sobre sobre tecidos ou células estranhas, o grau da resposta imune dependerá da semelhança da configuração dos antígenos de histocompatibilidade (HLA, antígenos leucocitários humanos, ou MHC, complexo principal de histocompatibilidade, (estes são sinônimos) antígenos).
A resposta imune é expressa no aparecimento de clones (descendentes de uma célula) de células estritamente especializadas em fatores estranhos específicos). Em outras palavras, se as células imunológicas começarem a reagir a alguma coisa, elas começarão a se dividir. E a divisão celular pode ser avaliada pela taxa de síntese de DNA. Quanto mais DNA é sintetizado, mais as células se dividem, mais ativas o desenvolvimento está em andamento resposta imune. O grau de síntese de DNA pode ser determinado pela inclusão na cultura celular do nucleotídeo radioativo timidina - o “bloco de construção” do DNA. A avaliação de uma cultura mista de linfócitos baseia-se neste princípio.
Tecnicamente isso é feito Da seguinte maneira. O sangue é retirado dos cônjuges, dos quais são isolados os linfócitos. Esses linfócitos são colocados em um ambiente favorável à divisão meio nutriente. Se você misturar linfócitos pessoas diferentes, eles começarão a reagir um ao outro. Porém, se você simplesmente registrar a atividade de uma cultura mista de pessoas diferentes, é impossível entender como uma determinada pessoa reage, porque as células de todos os participantes da cultura mista “entram na batalha”.
Para avaliar a reação individual de cada participante da cultura, as células de um dos cônjuges são expostas a um efeito que impossibilita a divisão celular. No entanto, as propriedades antigênicas dos linfócitos são preservadas. Nessa cultura, toda a atividade celular estará associada apenas às células vivas do outro cônjuge. Comparando várias combinações culturas de células vivas e inativadas podem ser obtidas informação importante sobre o grau de semelhança imunológica dos cônjuges.
Na verdade, nesta análise muito trabalhosa, são testadas 12 culturas diferentes, e a reação é avaliada no 3º e 5º dias de cultura.
Os 24 dígitos resultantes fornecem informações importantes sobre como uma mulher reagirá aos antígenos de histocompatibilidade do marido durante a gravidez.
O fato é que a manutenção da gravidez é um processo ativo. Tal como acontece com a reacção de rejeição, o reconhecimento imunológico adequado do intruso é importante para o desenvolvimento da tolerância imunológica na primeira fase. Se esse reconhecimento for lento ou ocorrer tarde demais, o embrião é atacado pelas células assassinas naturais da mãe e morre.
O SCL permite não só avaliar o estado de reconhecimento imunológico dos linfócitos dos cônjuges entre si, mas também monitorar o processo de tratamento por meio da imunização de linfócitos, selecionar o método e a dose de imunização e avaliar as perspectivas de utilização de um ou outro método de correção.
Portanto, quando é detectada uma configuração “ruim” de números no SCL, muitas vezes é necessário repeti-la após efeitos terapêuticos.
Pergunta:
Por favor, diga-me, é possível doar sangue para SCL após (4-5 dias) o paciente passar por um curso de infusão intravenosa de imunoglobulinas (para supressão do HSV-2; 3 conta-gotas de 25 ml em dias alternados)? As imunoglobulinas afetarão a confiabilidade da análise SCL?
Respondido por Kukhoreva Tatyana Aleksandrovna
Um curso de terapia com imunoglobulina pode afetar os resultados do SCL. Como a imunoglobulina afeta a atividade dos linfócitos, e na reação do SCL é essa atividade que é estudada (no estado espontâneo, após misturar o pool de células do doador com a cultura dos linfócitos do marido).
É aconselhável realizar o estudo antes do uso da imunoglobulina ou várias semanas (4-5) após a terapia.
Os resultados dos testes também podem ser afetados resfriados, vacinações, menstruação.
Pergunta:
De acordo com os resultados da análise, a intensidade da resposta no SCL é reduzida. No programa de FIV aos 14 DPP o hCG era 11. O que fazer?
Respondido por Airapetov David Yurievich
Clínica de Obstetrícia e Ginecologia "Centro de Imunologia e Reprodução":
O fato é que a criança é meio estranha ao corpo da mãe. Este é um fenômeno fisiológico normal que desencadeia reações imunológicas destinadas à manutenção da gravidez. Devem ser formadas proteínas protetoras especiais imunológicas que protegem óvulo. A incompatibilidade dos cônjuges em termos de antígenos HLA e a diferença entre o embrião e o organismo materno é ponto importante necessário para manter e levar uma gravidez. A semelhança dos cônjuges em termos de antígenos de histocompatibilidade leva à semelhança do embrião com o corpo da mãe, o que causa estimulação antigênica insuficiente do sistema imunológico da mulher, e as reações necessárias para manter a gravidez não são desencadeadas. A gravidez é percebida como células estranhas. Neste caso, ocorre o aborto espontâneo. Para diagnosticar esses fatores de aborto espontâneo, é realizado exame de genes HLA classe II (tipagem HLA-DRB1, DQA1 e DQB1), além de cultura mista de linfócitos. Uma ligeira diferença nos linfócitos dos cônjuges no MCL (cultura mista de linfócitos) e uma correspondência no HLA é uma indicação para linfocitoterapia. Tudo isso para aumentar a eficiência do reconhecimento dos antígenos do marido durante a formação da placenta, o que permite o início oportuno dos mecanismos de manutenção da gravidez.
Muita atenção está sendo dada atualmente à pesquisa sobre o papel mecanismos imunológicos no processo reprodutivo, pois sua violação leva ao desenvolvimento de infertilidade e interrupção antecipada gravidez. Estudos de parâmetros imunológicos e sua relação com processos reprodutivos permitiu-nos concluir que é necessário reconstruir o sistema imunitário na preparação do corpo da mãe para a gravidez, a partir do período ovulatório, no momento da implantação do embrião e Período inicial gravidez.
Uma das causas mais complexas e difíceis de diagnosticar de infertilidade e abortos espontâneos recorrentes é a disfunção imunológica.
Para detectar oportunamente a infertilidade imunológica, o laboratório de imunologia da reprodução realiza exames de casais por meio de seguintes métodos diagnóstico:
- estudo do nível de resposta proliferativa dos linfócitos de uma mulher aos antígenos do parceiro (em uma cultura mista de linfócitos)
- determinação da atividade de fatores bloqueadores no soro sanguíneo de uma mulher.
- avaliação do conteúdo quantitativo de subpopulações de células citotóxicas naturais em sangue periférico mulheres.
- imunograma estendido
- estudo do conteúdo de células reguladoras com atividade supressora no sangue periférico.
- ao identificar sintomas clínicos e sinais de laboratório Recomenda-se que o exame imunológico de pacientes com infertilidade seja submetido procedimento médico– aloimunização com linfócitos do marido, que é realizada de acordo com cronograma individual.
Consulta necessária:
- se na ausência de ginecológico e doenças endócrinas Com atividade sexual regular durante um ano não há gravidez.
- em caso de interrupções espontâneas repetidas (mais de uma vez) da gravidez (aborto espontâneo).
- no fertilização in vitro sem sucesso na anamnese.
- quando há ameaça de interrupção de uma gravidez real.
Se forem detectados distúrbios, um procedimento é prescrito para fins de imunocorreção de distúrbios aloimunização com linfócitos parceiros (AIL). Este método tratamento aprovado para uso Serviço federal para supervisão na área da saúde (licença FS nº 2009/179 de 02/07/2009)
O procedimento é realizado somente se o parceiro tiver resultados negativos análise para infecção por HIV, sífilis e hepatite viral(B, C). Nenhuma complicação foi identificada com AIL. O método AIL tem um efeito imunocorretivo pronunciado, aumenta a eficácia do tratamento da infertilidade, como em ciclo natural, e com fertilização in vitro(ECO). Também prescrito para tentativas malsucedidas de fertilização in vitro.
AIL é realizada uma vez a cada 28-30 dias (de acordo com ciclo menstrual mulheres) na 1ª fase do ciclo. O primeiro curso inclui 3 procedimentos AIL. Após o 2º procedimento, o casal faz novamente um teste de controle. Se houver dinâmica positiva, o terceiro procedimento AIL é o último. Se não houver dinâmica, a dose de células para imunização é aumentada e é realizado um 2º curso, incluindo 2 procedimentos. Após análise de controle, em alguns casos é necessário prescrever um 3º ciclo de imunização com aumento da dose de células. Depois de atingir os valores padrão, o efeito positivo dura de 6 a 8 meses.
Para o período de 2003 a 2013. No laboratório de imunoterapia celular foram realizados cerca de 3.000 procedimentos de aloimunização com linfócitos parceiros. Para esse procedimento, são isolados apenas linfócitos do sangue do parceiro, que estão sempre presentes no fluido do sêmen. Noutros países*, o procedimento de aloimunização também é realizado há 20 anos, o que ajuda uma mulher a carregar e dar à luz uma criança saudável.
| Tipo de serviço | preço, esfregue. |
| Teste de transformação de linfócitos (Detecção de sesibilização no século I) | 1650 |
| Teste de transformação de linfócitos (Detecção de sesibilização em 2b-va) | 2 900 |
| Teste de transformação de linfócitos (Detecção de sesibilização em 3b-va) | 3 900 |
| Teste de transformação de linfócitos (exame imunológico para infertilidade) | 3 200 |
| Imunograma estendido com marcadores de ativação | 4 625 |
| Estudo abrangente do estado imunológico | 4 125 |
| Vacinação (aloimunização com linfócitos do parceiro 1 dose) | 1 900 |
| Vacinação (aloimunização com linfócitos do parceiro, 2ª dose) | 2 750 |
| Vacinação (aloimunização com linfócitos do parceiro, 3ª dose) | 3 400 |
| Estudo de linfócitos CD16+/CD56+ (exame imunológico para infertilidade apenas células NK) | 1 250 |
| Estudo da atividade de macrófagos (meios de macrófagos condicionados) | 9 400 |
| Estudo da atividade de macrófagos (meio condicionado) | 1 500 |
| Criopreservação de células mononucleares para aloimunização | 650 |
SCL - cultura mista de linfócitos - MLC - cultura mista de linfócitos. Este teste consiste em um conjunto de culturas que determinam até que ponto os cônjuges reconhecem os antígenos de histocompatibilidade um do outro.
O linfócito é a célula central do sistema imunológico. O sistema linfocitário pode ser comparado a um estado, onde existem superiores e subordinados, e cada funcionário desempenha uma função especializada.
No CIR você pode fazer o teste de SCL
| Código do vendedor | Nome do serviço | Preço |
|---|---|---|
| Avaliação do risco de problemas de fertilidade com base num exame imunológico abrangente de um casal | ||
| 3736 | Programa 1: Avaliação do risco de problemas de fertilidade com base em um exame imunológico abrangente de um casal (consulta inicial com obstetra-ginecologista, ginecologista-endocrinologista, SKL, consulta repetida com obstetra-ginecologista, ginecologista-endocrinologista) | 12.000 rublos. |
| 3737 | Programa 2: Avaliação do risco de problemas de fertilidade com base em um exame imunológico abrangente de um casal (CSL, consultas repetidas com obstetra-ginecologista, ginecologista-endocrinologista) | 11.000 rublos. |
Se um linfócito encontrar quaisquer objetos estranhos ao corpo (bactérias, vírus, células estranhas, etc.), uma resposta imunológica se desenvolverá. Se estamos falando de tecidos ou células estranhas, então o grau de resposta imune dependerá da semelhança da configuração dos antígenos de histocompatibilidade (HLA, antígenos leucocitários humanos, ou MHC, compatibilidade de histocomplexo principal, (estes são sinônimos) antígenos) .
A resposta imune é expressa no aparecimento de clones (descendentes de uma célula) de células estritamente especializadas em fatores estranhos específicos). Em outras palavras, se as células imunológicas começarem a reagir a alguma coisa, elas começarão a se dividir. E a divisão celular pode ser avaliada pela taxa de síntese de DNA. Quanto mais DNA é sintetizado, mais células se dividem e mais ativa se desenvolve a resposta imunológica. O grau de síntese de DNA pode ser determinado pela inclusão na cultura celular do nucleotídeo radioativo timidina - o “bloco de construção” do DNA. A avaliação de uma cultura mista de linfócitos baseia-se neste princípio.
Tecnicamente, isso é feito da seguinte maneira. O sangue é retirado dos cônjuges, dos quais são isolados os linfócitos. Esses linfócitos são colocados em um meio nutriente favorável à divisão. Se você misturar linfócitos de pessoas diferentes, eles começarão a reagir entre si. Porém, se você simplesmente registrar a atividade de uma cultura mista de pessoas diferentes, é impossível entender como uma determinada pessoa reage, porque as células de todos os participantes da cultura mista “entram na batalha”.
Para avaliar a reação individual de cada participante da cultura, as células de um dos cônjuges são expostas a um efeito que impossibilita a divisão celular. No entanto, as propriedades antigênicas dos linfócitos são preservadas. Nessa cultura, toda a atividade celular estará associada apenas às células vivas do outro cônjuge. Ao comparar diversas combinações de culturas de células vivas e inativadas, pode-se obter informações importantes sobre o grau de similaridade imunológica dos cônjuges.
Na verdade, nesta análise muito trabalhosa, são testadas 12 culturas diferentes, e a reação é avaliada no 3º e 5º dias de cultura.
Os 24 dígitos resultantes fornecem informações importantes sobre como uma mulher reagirá aos antígenos de histocompatibilidade do marido durante a gravidez.
O fato é que a manutenção da gravidez é um processo ativo. Tal como acontece com a reacção de rejeição, o reconhecimento imunológico adequado do intruso é importante para o desenvolvimento da tolerância imunológica na primeira fase. Se esse reconhecimento for lento ou ocorrer tarde demais, o embrião é atacado pelas células assassinas naturais da mãe e morre.
A utilização do SCL, que começou no nosso centro na primavera de 2000, melhorou significativamente a qualidade do tratamento para pacientes com infertilidade, aborto espontâneo e tentativas malsucedidas FIV.
2.2. Métodos de interações celulares
Quase todos os métodos de interação celular utilizados na imunogenética clínica são baseados no fenômeno da formação de blastos em uma cultura mista de linfócitos, descoberto pela pesquisadora canadense Barbara Bain. A reação de uma cultura mista de linfócitos (MLC) permitiu um estudo finamente diferenciado do complexo HLA e, em particular, de uma de suas subunidades - o locus HLA-D. Vários outros métodos de interação celular - linfólise mediada por células (CML), teste de priming de linfócitos (Primed Lymphocyte Typing) - são baseados no método MLC ou o contêm como parte integrante.
2.2.1. Cultura Mista de Linfócitos (MCL)
O princípio do método é mostrado na Fig. 10, do qual fica claro que duas populações de linfócitos geneticamente diferentes interagem entre si em cultura in vitro. Uma das populações é tratada com mitomicina C ou irradiada, com isso perde a capacidade de formar blastos e incorporar timidina (3 HT), porém, sem perder suas propriedades antigênicas, mantém a capacidade de estimular (estimulantes; S -população).
As células que respondem à estimulação (respondentes, população R) transformam-se em blastos após alguns dias e incluem timidina adicionada à cultura. A intensidade da reacção é medida utilizando um marcador de radiação para a incorporação de 3H-timidina.
São conhecidas diversas variantes da reação de uma cultura mista de linfócitos, das quais duas são aqui propostas: a tradicional e a microvariante implementada em comprimidos de Cook (Fig. 11).
Arroz. 11. Equipamentos para microvariantes MLC e CML. 1 - comprimido de fundo redondo com 96 furos; Pipeta 2-automática ("Pipetman") com programa para volumes diferentes; 3 - pipeta automática (“Sigma”) para determinado volume; 4 - ponta de pipeta descartável; 5 – caixa de fluxo laminar
Versão tradicional do MLC (modificação por F. S. Baranova):
Os linfócitos são isolados num gradiente de Ficoll-urografina como descrito acima. A primeira lavagem é realizada em PBS (NaCl - 8,0 g, Na 2 HP0 4 - 1,15 g, KH 2 PO 4 - 0,2 g, KC1 - 0,2 g por 1 litro de H 2 O); os dois seguintes são produzidos em meio 199 com soro AB a 5% (pool de 15 doadores);
As células que respondem são ressuspensas em meio 199 com soro AB a 10% e a concentração celular é ajustada para 0,6 x 106 por ml;
Células estimulantes isoladas do mesmo modo a uma concentração de 5 - 106 por 1 ml são tratadas com mitomicina C (60 y/ml) de Serva e incubadas durante 40 minutos a 37°C num banho de água. Após incubação, as células são lavadas 3 vezes com meio 199 com soro AB a 5%, ressuspensas em meio 199 com soro AB a 10%, levando a concentração para 0,6 x 10 6 em 1 ml;
0,5 ml de células responsivas e 0,5 ml de células estimuladoras são misturados em um tubo de centrífuga, 0,04 ml de 10 ml de solução de Hepes (Serva) são adicionados e incubados por 144 horas; a experiência é colocada em três paralelos (tripleto);
24 horas antes do final da incubação, 3 H-timidina 1μCi (3,7x10 4 BC) é adicionado aos tubos de ensaio, a amostra de atividade específica é 5mCi/mmol (18,5x10 7 BC/mmol) e a incubação é continuada;
No final da incubação, as células são transferidas para filtros Milpore (0,6 - 0,9 mícron) e lavadas solução salina(37°C) e uma solução arrefecida de ácido tricloroacético a 5% (4°C). Os filtros são secos e colocados em frascos com 5 ml de líquido de cintilação (5 g de PPO e 0,5 g de POPOP - por 1 litro de tolueno)*. A atividade de incorporação de 3H-timidina é medida num contador β; o resultado é expresso em inclusões absolutas do marcador radioativo por 1 min ou no índice de estimulação (SI) de acordo com a fórmula:
* (PPO - 2,5-fenol-oxazol; POPOR - (1,4-di-2-15-fenoloxazolitebenzeno).)
Valor médio de CPM em três protótipos
SI = Valor médio de CPM em três amostras de controle/Culturas espontâneas de células respondentes servem como amostras de controle.
Versão micro do MLC em tablets Cook. No 8º Workshop foram desenvolvidos requisitos que padronizam a microopção do MLC, conforme abaixo exposto:
Os linfócitos são isolados em gradiente isopaque-ficoll e ressuspensos em meio RPMJ-1640*, elevando a concentração para 5x10 5 em 1 ml;
* (Pode ser utilizado o meio 199 misturado com soro humano do grupo AB (5% de soro retirado de vários indivíduos).)
As células estimuladoras são tratadas com mitomicina C ou treinamento;
Colocam-se 5x104 respondedores e o mesmo número de estimuladores utilizando uma micropipeta do tipo Pipetman em cada poço de uma microplaca Cook de fundo redondo;
As placas são incubadas em termostato com fornecimento automático de 5% de CO 2 por 120 horas; então lμmCi 3 H-timidina é adicionado a cada poço com uma atividade específica de timidina 6 Ci/mmol; todas as manipulações são realizadas com pipeta Pipetman;
16 horas após a adição de timidina, as culturas de cada poço são transferidas para filtros Milpore usando uma pipeta automática e lavadas com solução salina e depois com ácido tricloroacético a 5%; é conveniente usar “colheitadeiras” especiais para transferir a cultura para filtros Milpore;
A actividade de incorporação de timidina foi determinada como descrito acima.
2.2.2. Linfólise mediada por células (LMC)
A LMC tem sido usada em estudos imunogenéticos há relativamente pouco tempo (desde 1972), mas em Ultimamente está se tornando uma técnica cada vez mais popular, permitindo um estudo detalhado do papel do elo eferente da imunidade ao transplante e ganhando reconhecimento como método informativo monitoramento imunológico. O princípio do método é mostrado na Fig. 12. O método baseia-se na técnica proposta por J. Lightbody (1971), que é brevemente resumida a seguir.
1. A LMC começa com um teste HLC convencional, no qual as células que respondem reconhecem “estimuladores”, sensibilizam as células que respondem e formam células assassinas sensibilizadas.
2. A segunda fase, na qual as células killer sensibilizadas se misturam com as células alvo marcadas com 51Cr, consiste na destruição destas últimas pelas células killer efetoras; Células alvo podem ter o mesmo genótipo dos “estimuladores” da primeira fase da MLC, ou podem ser células de um “terceiro” parceiro, dotadas de determinantes antigênicos comuns aos “estimuladores” ou sem eles.
3. A quantidade de cromo radioativo liberada das células-alvo destruídas e liberada no meio de cultura serve como medida da intensidade do efeito assassino.
Arroz. 12. Princípio da linfólise mediada por células (LMC). Linha I - sensibilização de células responsivas, formação de células assassinas; Linha II - interação dos assassinos com o alvo; Linha III - destruição da célula alvo; rendimento meio de cultura 51 Cr
Três variantes de LMC são descritas aqui: a versão tradicional modificada por L.P. Alekseev (1979), a microvariante em comprimidos de Cook, LMC direta (Direct-CML -D-CML.
Opção tradicional[Alekseev L.P., 1979].
O método está dividido em várias etapas.
Conseguindo assassinos:
Os linfócitos periféricos de ambas as populações (células R e células S) são isolados da maneira habitual, lavados três vezes num gradiente de densidade em meio 199 com soro AB a 5% (10 min, 150 g);
1x10 6 células R (0,8 ml) são misturadas em tubos de centrífuga com 2x10 6 células S (0,2 ml) tratadas com mitomicina C e incubadas durante 144 horas a 37°C;
As células são centrifugadas a 150 g durante 10 minutos e o sedimento é ressuspenso em meio 199 com adição de 20% de soro de vitelo (meio 199 + i.e.), levando a concentração para 1x10 6 em 1 ml;
Uma das amostras é deixada para estudar o nível de MLC, as demais são usadas como assassinos prontos.
Obtendo alvos:
Os linfócitos isolados da maneira habitual são ressuspensos em meio 199 com soro AB a 20% e incubados com fitohemaglutinina (0,003 mg/ml Wellcome) durante 72 horas a 37°C; concentração celular 1x10 6 em 1 ml;
As células são centrifugadas durante 10 min a 150 g, o sedimento é ressuspenso em meio 199 com soro AB a 5% e a concentração celular é ajustada para 2x10 4 em 1 ml;
51 Cr 100 μCi/ml (3,7x10 6 BC/ml) é adicionado à suspensão e incubado durante 40 minutos a 37°C;
As células são lavadas três vezes em meio 199 com adição de soro AB a 5% (150 g, 10 min) e o sedimento é ressuspenso em meio 199 com soro AB a 5%. trazendo a concentração para 2x10 4 em 1 ml.
Configurando reações:
5x10 5 killers (0,5 ml) são misturados com 1x10 4 alvos (0,5 ml), incubados durante 4 horas (37°C) e centrifugados a 150 g durante 10 minutos;
O sobrenadante é aspirado e o impulso provocado pelo 51 Cr é contado num contador; a contagem é realizada em 0,5 ml de sobrenadante;
O nível de citólise é calculado usando a seguinte fórmula:
Ekper. saída 51 Cr - saída espontânea 51 Cr/máx, saída 51 Cr - saída espontânea 41 Cr × 100.
A libertação espontânea de crómio é medida em alvos incubados durante 4 horas (37°C) sem células assassinas; rendimento máximo de cromo - em alvos completamente destruídos por congelamento e descongelamento; Todos os testes são realizados em trigêmeos.
Microvariante de LMC em comprimidos [de acordo com Mawas S., 1976]:
A fase de obtenção de killers é realizada como MLC em placas de fundo redondo, mas as células R e S são misturadas em quantidades iguais, 2x10 5 pa cada poço e incubadas a 37°C;
Após 5 dias, as células são coletadas com pipeta Pasteur em um tubo de ensaio, o número de células vivas é contado com azul tripano e a concentração é ajustada para 10x10 6 em 1 ml;
As células alvo são cultivadas com PHA durante 3 dias;
No dia da reação, as células alvo são lavadas (300 g) e ressuspensas em meio de cultura, distribuindo 1 ml em tubos de ensaio e ajustando para 1x10 6 em 1 ml;
Adicione 200 μCi 51 Cr (7,4x10 6 BC) a cada tubo com células alvo e incube por 1 hora a 37°C; lave as células 3 vezes; o sedimento é ressuspenso e ajustado para uma concentração de 1x10 em 1 ml (vivo);
O teste é implementado em microplacas de fundo redondo; para isso, 0,7 - 1x10 6 células assassinas (0,1 ml) e 1x10 4 células alvo (0,1 ml) são distribuídas em cada poço; o volume total da suspensão em cada poço é de 0,2 ml, adicionar 0,05 ml de meio em cada poço e incubar (37°C) por 4 horas;
As placas são centrifugadas a 800 g numa centrífuga Beckman durante 10 minutos; o sobrenadante de cada poço é transferido para tubos de ensaio e contado em um contador γ;
A fase de produção de células killer (MLC) é realizada em meio RPMJ-1640 com adição de 20% de plasma humano; para a fase de morte, utilizar meio MEM com adição de 20% de plasma humano, pré-aquecido.
LMC direta (D-CML). A LMC direta é uma técnica desenvolvida especificamente para fins clínicos que tem sido utilizada no monitoramento imunológico. O esquema desta reação é mostrado na Fig. 13.
A principal diferença da LMC tradicional é que a fase de formação das células assassinas (fase de sensibilização) não ocorre in vitro, mas in vivo, ou seja, no corpo humano sensibilizado pelo transplante de um órgão ou tecido alogênico. Devido ao efeito do tecido alogênico, os linfócitos do receptor são sensibilizados aos antígenos do tecido do doador e não necessitam de tratamento especial in vitro, a duração do teste é significativamente reduzida no tempo, pois apenas os alvos devem ser preparados primeiro;
Os alvos utilizados são linfócitos obtidos do sangue periférico ou, mais frequentemente, do baço do doador (ver 2.1.2) e congelados por qualquer um dos métodos descritos acima (ver 2.1.3).
2.2.3. Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC)
Este tipo de resposta celular é semelhante em mecanismo de ação à LMC descrita acima. O princípio da reação é mostrado na Fig. 14. Os componentes da reação são células-alvo (células doadoras ou linfócitos alogênicos), soro (alogênico ou receptor), presumivelmente contendo anticorpos direcionados aos determinantes das células-alvo, e células efetoras (linfócitos receptores ou linfócitos alogênicos).
As células efetoras nesse tipo de interação são as chamadas células K localizadas no sangue periférico. Ao contrário das células killer na LMC, elas exercem efeito citotóxico sem sensibilização prévia, porém, a manifestação do efeito citotóxico das células K só é possível por meio de anticorpos direcionados aos determinantes das células-alvo. A lise específica é medida pela libertação de 51 Cr se o soro de teste contiver anticorpos para os determinantes alvo.
Os determinantes alvo no ADCC podem ser praticamente as especificidades de todos os loci HLA, incluindo HLA-D, HLA-DR, bem como determinantes fora do sistema HLA.
Esta reação complexa é mais difundida no monitoramento imunológico para detectar anticorpos de células B. Nesse sentido, diversas modificações foram propostas, prevendo o enriquecimento da suspensão de células alvo com linfócitos B, a adsorção do soro nas plaquetas, etc.
Além disso, uma série de outras características de resposta neste sistema são levadas em consideração. O soro teste deve ser descomplementado, pois de outra forma a reação pode ser citotoxicidade dependente do complemento mediada por anticorpos. Supõe-se também que as células efetoras podem causar certa destruição de alvos de acordo com o tipo de LMC.
Em última análise, todo o conjunto de amostras no teste de linfocitotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos é o seguinte:
Alvos + efetores + soro teste (amostra experimental);
Alvos (amostra de controle, ou seja, liberação espontânea de 51 Cr);
Alvos + efetores (teste de controle para atividade efetora);
Alvos + soro teste (soro controle).
Os linfócitos foram isolados rotineiramente e ressuspensos em RPMI-1640 + soro fetal bovino a 10%; tratar a suspensão com ferro carbonílico para remover monócitos; adicionar cloreto de amônio ou H 2 O para lisar os glóbulos vermelhos restantes;
51 Cr na forma de uma solução de Na 2 CrO 4 100 - 200 µCi ml (3,7x10 6 - 7,4x106 BC/ml) é adicionado à suspensão de células alvo e incubado durante 40 - 60 minutos;
As células são lavadas três vezes em RPMI + HSA a 0,1%, ressuspensas no mesmo meio e ajustadas para 2x10 8 em 1 ml; 50 µl de uma suspensão de células marcadas são colocados em um tubo de ensaio e a atividade isotópica é subsequentemente calculada em um contador γ para identificar a “assimilação” isotópica completa; o restante é despejado nos poços da placa, 50 µl de suspensão (1x10 5 células por poço);
A suspensão de células efectoras é levada a 2x107 células em 1 ml e c. cada poço é preenchido com 50 µl de suspensão (ou 100 µl), a proporção de efetores para alvos é de 10:1 (ou 20:1);
A incubação continua por 4 horas em atmosfera úmida com termostato e 5% de CO 2 (a duração da incubação pode ser estendida até 8 horas);
Preparar diversas diluições do soro teste em tubos de ensaio (1:25; 1:100) e adicionar aos poços até 50 µl de cada diluição: e soro não diluído; a configuração final do teste é mostrada na tabela. 23.
Tabela 23
Encenação do ADCC. Todas as opções de amostra, µl
* (Em vez do soro teste, é instilado um conjunto de soros AB.)
** (Em vez do soro teste, é instilado um soro HLA monoespecífico direcionado contra alvos (não efetores).)
A incubação dos painéis continua durante 4 horas numa atmosfera humidificada com 4% de CO2; a duração da incubação pode ser estendida até 8 horas;
Após a incubação, metade do volume de cada poço (100 μl) é cuidadosamente aspirado com uma pipeta automática e colocado em tubos de contagem de pulsos de 51 Cr; a atividade é contada em um contador γ;
Os cálculos são os seguintes:
% de liberação de 51 Cr = 2 × A op - atividade de base/B - atividade de base × 100;
% de citotoxicidade = A op - A sp /100 - A sp × 100, onde A op é a % de liberação de 51 Cr em amostras experimentais; A sp - % liberação espontânea; B - assimilação completa do isótopo.
Como resultado positivo 5% ou mais de citotoxicidade é considerada após 4 horas de incubação.
MCL (cultura mista de linfócitos) é um teste que permite determinar até que ponto o sistema imunológico dos cônjuges reconhece os antígenos de histocompatibilidade um do outro.
Um tipo de célula sanguínea, os linfócitos, são a base do sistema imunológico. Ao mesmo tempo, existe uma certa hierarquia entre as células leucocitárias, existem células principais, existem células subordinadas, cada uma das quais desempenha a sua função.
Quando um linfócito encontra objetos estranhos ao corpo (células de outro organismo, vírus, bactérias, etc.), desenvolve-se uma resposta imunológica. A força da resposta imune dependerá da semelhança na estrutura dos antígenos de histocompatibilidade ( HLA- antígenos).
A resposta imune é expressa no aparecimento de clones descendentes de uma célula, e estas são células estritamente especializadas em fatores estranhos específicos aos quais é necessária uma resposta. Em outras palavras, a reação das células imunológicas a alguma coisa é que elas começam a se dividir. A divisão celular pode ser avaliada pela taxa de síntese de DNA. Quanto mais DNA é sintetizado, mais intensamente as células se dividem, quanto mais existem, mais ativo é o desenvolvimento da resposta imune. A intensidade da formação de DNA pode ser detectada incluindo um nucleotídeo radioativo de um dos “blocos de construção” do DNA, a timidina, na cultura celular. É exatamente assim que uma cultura mista de linfócitos é avaliada.
Tecnicamente, isso pode ser feito assim. O sangue é retirado de ambos os cônjuges, dos quais são isolados os linfócitos, que são colocados em meio nutriente favorável à divisão. Quando os linfócitos de pessoas diferentes se misturam, eles começam a reagir entre si. No entanto, se simplesmente registrarmos a atividade de formação de DNA em uma cultura mista de pessoas diferentes, será impossível entender como uma determinada pessoa reage a outra. pessoa específica, porque as células de todas aquelas pessoas cujos linfócitos são colocados no meio começam a “brigar”.
Para avaliar a resposta individual, as células de um dos cônjuges são expostas a uma influência que impossibilita a sua divisão. No entanto, as propriedades antigênicas dos linfócitos são preservadas. Neste caso, toda a atividade celular na cultura estará associada apenas às células vivas do outro cônjuge. Ao comparar várias combinações de culturas de células vivas e incapazes, pode-se obter informação necessária sobre o grau de semelhança imunológica dos cônjuges.
A análise envolve o estudo de 12 culturas diferentes, cuja avaliação da reação é realizada no 3º e 5º dias.
O resultado são 24 dígitos que fornecem informações sobre a reação de uma determinada mulher aos antígenos de histocompatibilidade de seu marido durante a implantação e durante a gravidez.
Não apenas a rejeição imunológica, mas também a defesa imunológica da gravidez é um processo ativo. Para o desenvolvimento da tolerância imunológica na primeira fase, é importante o correto reconhecimento imunológico do DNA do marido contido no embrião. Se este reconhecimento for lento, lento e acontecer demasiado tarde, então o embrião é atacado pelas células assassinas naturais da mãe e morre.
A análise SCL permite não só avaliar o estado de reconhecimento imunológico dos linfócitos dos cônjuges entre si, mas também monitorar o processo de tratamento por meio da imunização com linfócitos, escolher o método e a dose de imunização e avaliar as perspectivas de utilização de um ou outro método de corrigir a situação. Portanto, após a imunização, o teste para SCL deverá ser repetido.
