Смешанная культура лимфоцитов инвитро. Что такое СКЛ? В ЦИР вы можете пройти обследование по СКЛ

СКЛ - смешанная культура лимфоцитов
MLC - mixed lymphocyte culture

Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.

Лимфоцит - центральная клетка иммунной системы. Систему лимфоцитов можно сравнить с государством, где есть начальники и подчиненные, а каждый служащий выполняет специализированную функцию.

Если лимфоцит встречает любые чужеродные для организма объекты (бактерии, вирусы, чужие клетки и т. д.), то развивается иммунный ответ. Если речь идет о чужих тканях или клетках, то степень иммунного ответа будет зависеть от похожести конфигурации антигенов тканевой совместимости (HLA, human leucocyte antigens, или MHC, major histocompatibility complex, (это синонимы) антигенов).

Иммунный ответ выражается в появлении клонов (потомков одной клетки) клеток, строго специализированных к конкретным чужеродным факторам). Другими словами, если иммунные клетки начинают реагировать на что-то, они начинают делиться. А деление клеток можно оценить по скорости синтеза ДНК. Чем больше синтезируется ДНК - тем сильнее делятся клетки, тем активнее идет развитие иммунного ответа. Степень синтеза ДНК можно определить по включению в культуру клеток радиоактивного нуклеотида тимидина - "кирпичика" ДНК. На этом принципе основана оценка смешанной культуры лимфоцитов.

Технически это делается следующим образом. У супругов берут кровь, из которой выделяют лимфоциты. Эти лимфоциты помещают в благоприятную для деления питательную среду. Если смешать лимфоциты разных людей, они начнут друг на друга реагировать. Однако если просто зарегистрировать активность смешанной культуры разных людей, невозможно понять, как реагирует конкретный человек, потому что "в бой" вступают клетки всех участников смешанной культуры.

Для того, чтобы оценить индивидуальную реакцию каждого участника культуры, клетки одного из супругов подвергают воздействию, которое делает невозможным деление клеток. Однако антигенные свойства лимфоцитов при этом сохраняются. В такой культуре вся активность клеток будет связана только с живыми клетками другого супруга. Сравнивая различные комбинации культур живых и инактивированных клеток можно получить важную информацию о степени иммунологической похожести супругов.

Фактически в этом анализе, очень трудоемком, ставится 12 различных культур, а оценка реакции проводится на 3-и и 5-е сутки культуры.

Полученные 24 цифры позволяют получить важную информацию о том, как будет реагировать женщина на антигены тканевой совместимости мужа во время беременности.

Дело в том, что сохранение беременности - активный процесс. Так же, как при реакции отторжения, для развития иммунологической толерантности на первом этапе важно адекватное иммунологическое распознавание пришельца. Если это распознавание вялое, или если оно происходит слишком поздно, зародыш атакуется естественными клетками киллерами матери и погибает.

СКЛ позволяет не только оценить состояние иммунологического распознавания лимфоцитов супругов друг другом, но и проконтролировать процесс лечения с помощью иммунизации лимфоцитами, выбрать метод и дозу иммунизации, оценить перспективы применения того или иного способа коррекции.

Поэтому при обнаружении "плохой" конфигурации цифр в СКЛ, часто приходится ее повторять уже после лечебных воздействий.

Вопрос:
Подскажите, пожалуйста, можно ли сдать кровь на СКЛ после (через 4-5 дней) прохождения пациенткой курса внутривенного вливания иммуноглобулинов (для супрессии ВПГ-2; 3 капельницы по 25 мл через день)? Не повлияют ли иммуноглобулины на достоверность анализа СКЛ?

Отвечает Кухорева Татьяна Александровна

Проведение курса терапии иммуноглобулинами может повлиять на результаты СКЛ. Поскольку иммуноглобулин воздействует на активность лимфоцитов, а в реакции СКЛ исследуется именно эта активность (в спонтанном состоянии, после смешивания с культурой лимфоцитов мужа, пула донорских клеток).
Желательно проводить исследование до использования иммуноглобулина либо через несколько недель (4-5) после терапии.
На результаты теста также могут влиять простудные заболевания, проведений вакцинаций, менструация.

Вопрос:
По результатам анализа интенсивность ответа в СКЛ снижена. В программе ЭКО на 14 ДПП ХГЧ был 11. Что делать?

Отвечает Айрапетов Давид Юрьевич
акушерско-гинекологическая клиника "Центр иммунологии и репродукции":
Дело в том, что ребенок является наполовину чужеродным для организма матери. Эта является нормальным физиологическим явлением, запускающим иммунологические реакции, направленные на сохранение беременности. Должны формироваться иммунные специальные защитные белки, которые оберегают плодное яйцо. Несовместимость супругов по HLA-антигенам и отличие зародыша от материнского организма является важным моментом, необходимым для сохранения и вынашивания беременности. Сходство супругов по антигенам тканевой совместимости приводит к похожести зародыша на организм матери, что становится причиной недостаточной антигенной стимуляции иммунной системы женщины, и необходимые для сохранения беременности реакции не запускаются. Беременность воспринимается, как чужеродные клетки. В таком случае происходит самопроизвольное прерывание беременности. Для диагностики таких факторов невынашивания беременности проводится обследование на HLA-гены II класса (HLA-DRB1, DQA1 и DQB1-типирование), а также смешанная культура лимфоцитов. Слабое различие лимфоцитов супругов в СКЛ (смешанная культура лимфоцитов) и совпадение по HLA является показанием для проведения лимфоцитотерапии. Все это делается для того, чтобы повысить эффективность узнавания антигенов мужа в процессе формирования плаценты, что позволяет вовремя запустить механизмы сохранения беременности.

Большое внимание в настоящее время уделяется исследованию роли иммунных механизмов в репродуктивном процессе, поскольку их нарушение приводит к развитию бесплодия и раннему прерыванию беременности. Исследования иммунологических параметров и их взаимосвязи с репродуктивными процессами позволили сделать вывод о необходимости перестройки иммунной системы при подготовке организма матери к беременности, начиная с овуляторного периода, в момент имплантации эмбриона и в ранний период беременности.

Одной из наиболее сложных и трудно диагностируемых причин бесплодия и повторяющихся спонтанных выкидышей являются иммунные дисфункции.

С целью своевременного выявления иммунологическог о бесплодия в лаборатории иммунологии репродукции проводится обследование супружеских пар с использованием следующих методов диагностики:

исследование уровня пролиферативного ответа лимфоцитов женщины на антигены партнера(в смешанной культуре лимфоцитов)
определение активности блокирующих факторов в сыворотке крови женщины.
оценка количественного содержания субпопуляций естественных цитотоксических клеток в периферической крови женщины.
расширенная иммунограмма
исследование содержания регуляторных клеток с супрессорной активностью в периферической крови.
при выявлении клинических и лабораторных признаков иммунологическог о бесплодия пациентам рекомендовано проведение лечебной процедуры – аллоиммунизации лимфоцитами мужа, которая проводится в соответствии с индивидуальным графиком.

Консультация необходима:

если при отсутствии гинекологических и эндокринных заболеваний при регулярной половой жизни в течении года нет беременностей.
в случае повторяющихся(более 1раза) спонтанных прерываний беременности (выкидыше).
при неудачных ЭКО в анамнезе.
при угрозе прерывания настоящей беременности.

При выявлении нарушений с целью иммунокоррекции нарушений назначается процедура аллоиммунизации лимфоцитами партнера (АИЛ) . Данный метод лечения разрешен к применению Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения (лицензия ФС№2009/179 от 02.07.2009)

Процедура проводится только при наличии у партнера отрицательных результатов анализа на ВИЧ-инфекции, сифилис и вирусные гепатиты (В, С). Осложнения при АИЛ не выявлено. Метод АИЛ обладает выраженным иммунокорригирующим эффектом, повышает эффективность лечения бесплодия, как в естественном цикле, так и при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО). Также назначается при неудачных попытках экстракорпорального оплодотворения.

АИЛ проводится 1 раз в 28-30 дней (в соответствии с менструальным циклом женщины) в 1-ую фазу цикла. Первый курс включает 3 процедуры АИЛ. После 2-ой процедуры пара повторно сдает контрольный анализ. При наличии позитивной динамики третья процедура АИЛ является последней. При отсутствии динамики — доза клеток для иммунизации увеличивается и проводится 2-ой курс, включающий 2 процедуры. После контрольного анализа в некоторых случаях необходимо назначение 3 курса иммунизации с увеличением дозы клеток. После достижения нормативных значений позитивный эффект держится в пределах 6-8 месяцев.

За период с 2003 по 2013гг. в лаборатории клеточной иммунотерапии было проведено около 3000 процедур аллоиммунизации лимфоцитами партнеров. Для данной процедуры из крови партнера выделяются только лимфоциты, которые всегда присутствуют в спермальной жидкости. В других странах* на протяжении 20 лет также проводится процедура аллоиммунизации, которая помогает женщине выносить и родить здорового ребенка.

Вид услуги	Цена, руб.
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 1в-во)	1650
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 2в-ва)	2 900
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 3в-ва)	3 900
Тест трансформации лимфоцита (иммунологическое обследование при бесплодии)	3 200
Иммунограмма расширенная с активационными маркерами	4 625
Комплексное исследование иммунного статуса	4 125
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 1 доза)	1 900
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 2 доза)	2 750
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 3 доза)	3 400
ИсследованиеCD16+/CD56+ лимфоцитов(иммунологическое обследование при бесплодии только НК-клетки)	1 250
Исследование макрофагальной активности (кондиционные среды макрофагов)	9 400
Исследование макрофагальной активности (кондиционные среды)	1 500
Криоконсервирование мононуклеаров для аллоиммунизации	650

СКЛ - смешанная культура лимфоцитов - MLC - mixed lymphocyte culture. Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.

В ЦИР вы можете пройти обследование по СКЛ

Артикул	Наименование услуги	Стоимость
Оценка риска проблем фертильности по комплексному иммунологическому обследованию супружеской пары
3736	Программа 1: Оценка риска проблем фертильности по комплексному иммунологическому обследованию супружеской пары (первичная консультация акушера-гинеколога,гинеколога-эндокринолога,СКЛ,повторная консультация акушера-гинеколога,гинеколога-эндокринолога)	12 000 р.
3737	Программа 2: Оценка риска проблем фертильности по комплексному иммунологическому обследованию супружеской пары (СКЛ, повторная консультация акушера-гинеколога,гинеколога-эндокринолога)	11 000 р.

Использование СКЛ, которое было начато в нашем центре с весны 2000 г., позволило значительно улучшить качество лечение пациенток с бесплодием, невынашиванием беременности и неудачными попытками IVF.

2.2. Методы клеточных взаимодействий

В основе почти всех методов клеточных взаимодействий, используемых клинической иммуногенетикой, лежит феномен бластооб- разования в смешанной культуре лимфоцитов, открытый канадской исследовательницей Барбарой Бейн . Реакция смешанной культуры лимфоцитов (mixed lymphocyte culture - MLC) позволила осуществить тонкое дифференцированное изучение комплекса HLA и, в частности, одной из его субъединиц - локуса HLA-D. Ряд других методов клеточных взаимодействий - клеточно-опосредованный лимфолизис (Cell-mediated Lympholysis - CML), тест примирования лимфоцитов (Primed Lymphocyte Typing) - основывается на методе MLC или содержит его как составную часть.

2.2.1. Смешанная культура лимфоцитов (MCL)

Принцип метода изображен на рис. 10, из которого видно, что две популяции различающихся генетически лимфоцитов взаимодействуют между собой в культуре in vitro. Одна из популяций обрабатывается митомицином С или облучается, в результате чего теряет способность к бластообразованию и включению тимидина (3 НТ), однако, не теряя антигенных свойств, сохраняет способность к стимуляции (стимуляторы; S-популяция).

Клетки, отвечающие на стимуляцию (респондеры, R-популяция), через несколько дней трансформируются в бласты и включают тимидин, добавляемый в культуру. Интенсивность реакции измеряется с помощью радиационной метки по включению 3 Н-тимидина.

Известны несколько вариантов реакции смешанной культуры лимфоцитов, из которых здесь предлагаются два: традиционный и микровариант, реализуемый в планшетах Cook (рис. 11).

Рис. 11. Оборудование для микровариантов MLC и CML. 1 - планшет круглодонный е 96 лунками; 2-автоматическая пипетка ("Pipetman") с программой для разных объемов; 3 - автоматическая пипетка ("Sigma") для определенного объема; 4 - наконечник для пипетки одноразового использования; 5 - ламинарный бокс

Традиционный вариант MLC (модификация Ф. С. Барановой):

Лимфоциты выделяют на фиколл-урографиновом градиенте, как описано выше. Первую отмывку производят в PBS (NaCl - 8,0 г, Na 2 HP0 4 - 1,15 г, KH 2 PO 4 - 0,2 г, KC1 - 0,2 г на 1л H 2 O); две последующие производят в среде 199 с 5%-АВ-сыворотки (пул от 15 доноров);

Отвечающие клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ и доводят концентрацию клеток до 0,6 x 10 6 в 1 мл;

Выделенные таким же образом стимулирующие клетки в концентрации 5 - 10 6 в 1 мл обрабатывают митомицином С (60 γ/мл) фирмы "Serva" и инкубируют 40 мин при 37°С в водяной бане. После инкубации клетки отмывают 3 раза средой 199 с 5% сывороткой АВ, ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ, доводя концентрацию до 0,6 x 10 6 в 1 мл;

0,5 мл отвечающих клеток и 0,5 мл стимулирующих клеток смешивают в центрифужной пробирке, прибавляют 0,04 мл 10 мл р-ра Hepes ("Serva") и инкубируют 144 ч; опыт ставят в трех параллелях (триплет);

За 24 ч до окончания инкубации в пробирки добавляют 3 Н-тимидин 1μCi (3,7x10 4 БК), на пробу удельной активности 5mСi/мМоль (18,5x10 7 БК/мМоль) и продолжают инкубацию;

По окончании инкубации клетки переносят на миллипоровые фильтры (0,6 - 0,9 микрон), промывают физиологическим раствором (37°С) и охлажденным 5% раствором трихлоруксусной кислоты (4°С). Фильтры сушат и помещают во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкостью (5 г РРО и 0,5 г РОРОР - на 1 л толуола) * . Активность включения 3 Н-тимидина замеряют на β-счетчике; результат выражают в абсолютных включениях радиоактивной метки в 1 мин или в индексе стимуляции (ИС) по формуле:

* (РРО - 2,5-фенол-оксазол; РОРОР - (1,4-ди-2-15-фенолоксазолитбензол). )

Среднее значение СРМ в трех опытных образцах

ИС = Среднее значение СРМ в трех контрольных образцах/Контрольными образцами служат спонтанные культуры отвечающих клеток.

Микровариант MLC в планшетах Cook . На 8-м Уоркшопе выработаны требования, стандартизирующие микровариант MLC, в соответствии с которыми он излагается ниже :

Лимфоциты выделяют в градиенте изопак-фиколла и ресуспендируют в среде RPMJ-1640 * , доводя концентрацию до 5х10 5 в 1 мл;

* (Можно использовать среду 199, смешанную с человеческой сывороткой группы АВ (5% сыворотки, взятой от нескольких индивидов). )

Клетки-стимуляторы обрабатывают митомицином С или обучением;

5x10 4 репондеров и столько же стимуляторов помещают с помощью микропипетки типа Pipetman в каждую лунку круглодонного микропланшета Cook;

Планшеты инкубируют в термостате с автоматической подачей 5% CO 2 в течение 120 ч; затем в каждую лунку вносят lμmCi 3 Н-тимидина при специфической активности тимидина 6 Ci/мМоль; все манипуляции проводят пипеткой Pipetman;

Через 16 ч после внесения тимидина культуры из каждой лунки автоматической пипеткой переносят на миллипоровые фильтры и промывают физиологическим раствором, а затем 5% трихлоруксусной кислотой; удобно использовать специальные "харвестеры" для переноса культуры на миллипоровые фильтры;

Активность включения тимидина определяют, как описано выше.

2.2.2. Клеточно-опосредованный лимфолизис (CML)

CML используется в иммуногенетических исследованиях сравнительно недавно (с 1972 г.), однако в последнее время становится все более популярной техникой, позволяя детально изучить роль эфферентного звена трансплантационного иммунитета и завоевывая признание как информативный метод иммунологического мониторинга. Принцип метода изображен на рис. 12. В основе метода лежит техника, предложенная J. Lightbody (1971), которая вкратце сводится к следующему.

1. CML начинается с обычного HLC-теста, в котором происходит распознавание отвечающими клетками "стимуляторов", сенсибилизация отвечающих клеток и формирование сенсибилизированных киллеров.

2. Вторая фаза, в которой сенсибилизированные киллеры смешиваются с меченными 51 Сr клетками-мишенями, состоит в деструкции последних эффекторными клетками-киллерами; клетки- мишени могут иметь генотип такой же, как "стимуляторы" в первой фазе MLC, а могут быть клетками "третьего" партнера", наделенными общими со "стимуляторами" антигенными детерминантами или без них.

3. Количество радиоактивного хрома, высвобождающегося из разрушенных клеток-мишеней и выходящего в культуральную среду, служит мерой интенсивности киллер-эффекта.

Рис. 12. Принцип клеточно-опосредованного лимфолизиса (CML). I ряд - сенсибилизация отвечающих клеток, образование киллеров; II ряд - взаимодействие киллеров с мишенью; III ряд - разрушение клетки-мишени; выход 51 Cr культуральную среду

Здесь описано три варианта CML: традиционный вариант в модификации Л. П. Алексеева (1979), микровариант в планшетах Cook, прямая CML (Direct-CML -D-CML.

Традиционный вариант [Алексеев Л. П., 1979].

Метод разделен на несколько этапов.

Получение киллеров :

Периферические лимфоциты обеих популяций (R-клетки и S-клетки) выделяют обычным путем, в градиенте плотности отмывают трижды в среде 199 с 5% АВ-сывороткой (10 мин, 150 g);

1x10 6 R-клеток (0,8 мл) смешивают в центрифужных пробирках с 2x10 6 S-клеток (0,2 мл), обработанных митомицином С, и инкубируют 144 ч при 37°С;

Клетки центрифугируют при 150 g в течение 10 мин, а осадок ресуспендируют в среде 199 с добавлением 20% телячьей сыворотки (среда 199 + т. е.), доведя концентрацию до 1x10 6 в 1 мл;

Одну из проб оставляют для исследования уровня MLC, остальные используют как готовые киллеры.

Получение мишеней :

Выделенные обычным путем лимфоциты ресуспендируют в среде 199 с 20% АВ-сывороткой и инкубируют с фитогемагглютинином (0,003 мг/мл Wellcome) в течение 72 ч при 37°С; концентрация клеток 1x10 6 в 1 мл;

Клетки центрифугируют 10 мин при 150 g, осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой и доводят концентрацию клеток до 2x10 4 в 1 мл;

К взвеси добавляют 51 Cr 100 μCi/мл (3,7x10 6 БК/мл) и инкубируют 40 мин при 37°С;

Клетки трижды отмывают в среде 199 с добавкой 5% АВ-сыворотки (150 g, 10 мин) и осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой,. доведя концентрацию до 2x10 4 в 1 мл.

Постановка реакций :

5x10 5 киллеров (0,5 мл) смешивают с 1x10 4 мишеней (0,5 мл), инкубируют 4 ч (37°С) и центрифугируют при 150 g 10 мин;

Суспернатант отсасывают и на?-счетчике подсчитывают импульсацию, вызываемую 51 Cr; подсчет ведут в 0,5 мл супернатанта;

Уровень цитолиза подсчитывают по следующей формуле:

экепер. выход 51 Cr - спонтанный выход 51 Cr/максим, выход 51 Cr - спонтанный выход 41 Cr × 100.

Спонтанный выход хрома измеряется на мишенях, инкубированных 4 ч (37°С) без клеток-киллеров; максимальный выход хрома - на мишенях, полностью разрушенных замораживанием-оттаиванием; все пробы осуществляются в триплетах.

Микровариант CML в планшетах [по Mawas С., 1976]:

Фаза получения киллеров осуществляется как MLC в круглодонных планшетах, но смешивают в равных количествах R- и S-клетки по 2x10 5 па каждую лунку и инкубируют при 37°С;

Через 5 сут клетки собирают пастеровской пипеткой в пробирку, подсчитывают с трипаном голубым число живых и доводят концентрацию до 10x10 6 в 1 мл;

Клетки-мишени в течение 3 дней культивируют с ФГА;

В день постановки реакции клетки-мишени отмывают (300 g) и ресуспендируют в культуральной среде, распределяя по 1 мл в пробирки и доводя до 1x10 6 в 1 мл;

Добавляют в каждую пробирку с клетками-мишенями по 200 μCi 51 Cr(7,4x10 6 БК) и инкубируют 1 ч при 37°С; отмывают клетки 3 раза; осадок ресуспендируют и доводят до концентрации 1x10 в 1 мл (живых);

Тест реализуется в круглодонных микропланшетах; для этого распределяют в каждую лунку 0,7 - 1x10 6 клеток-киллеров (0,1 мл) и 1x10 4 клеток-мишеней (0,1 мл); общий объем суспензии в каждой лунке 0,2 мл, добавляют в каждую лунку по 0,05 мл среды и инкубируют (37°С) 4 ч;

Планшеты центрифугируют при 800 g на центрифуге Beckman в течение 10 мин; супернатант из каждой лунки переносят в пробирки и подсчитывают на γ-счетчике;

Фазу получения киллеров (MLC) проводят на среде RPMJ-1640 с добавлением 20% человеческой плазмы; для фазы киллинга употребляют среду MEM с добавлением 20% человеческой плазмы, предварительно прогретой.

Прямая CML (D-CML). Прямая CML является техникой, созданной специально для клинических целей, нашедшей использование при иммунологическом мониторинге. Схема этой реакции изображена на рис. 13.

Основное отличие от традиционной CML состоит в том, что стадия образования киллеров (фаза сенсибилизации) протекает не in vitro, a in vivo, т. е. в организме человека, сенсибилизированного пересадкой аллогенного органа или ткани. Вследствие воздействия аллогенной ткани лимфоциты реципиента сенсибилизированы к тканевым антигенам донора и не нуждаются в специальной обработке in vitro, продолжительность теста значительно сокращается во времени, так как предварительно следует подготовить только мишени.

В качестве мишеней используют лимфоциты, полученные из периферической крови или, чаще, из селезенки донора (см. 2.1.2) и замороженные любым из описанных выше способов (см. 2.1.3).

2.2.3. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (Antibody-dependent-cell mediated Cytotoxicity - ADCC)

Этот тип клеточных реакций сходен по механизмам действия с описанной выше CML. Принцип реакции изображен на рис. 14. Компонентами реакции являются клетки-мишени (донорские клетки или аллогенные лимфоциты), сыворотка (аллогенная или реципиента), предположительно содержащая антитела, направленные к детерминантам клеток-мишеней, и клетки-эффекторы (лимфоциты реципиента или аллогенные лимфоциты).

Клетками-эффекторами в данном типе взаимодействия служат так называемые К-клетки, находящиеся в периферической крови. В отличие от клеток-киллеров в CML они осуществляют цитотоксический эффект без предварительной сенсибилизации, однако проявление цитотоксического действия К-клеток возможно только через посредство антител, направленных к детерминантам клеток-мишеней . Специфический лизис измеряется по высвобождению 51 Cr, если исследуемая сыворотка содержит антитела к детерминантам мишеней.

Детерминантами-мишенями в ADCC могут быть практически специфичности всех HLA-локусов, включая HLA-D, HLA-DR, а также детерминанты, лежащие вне HLA-системы .

Наибольшее распространение эта сложная реакция получила в иммунологическом мониторинге для выявления В-клеточных антител. В связи с этим было предложено несколько модификаций, предусматривающих обогащение суспензии клеток-мишеней В-лимфоцитами, адсорбцию сывороток на тромбоцитах и т. д.

Помимо всего, учитывается ряд других особенностей реагирования в данной системе. Исследуемая сыворотка должна быть декомплементирована, так как в противном случае реакция может пойти по типу антитело-опосредованной комплементзависимой цитотоксичности. Предполагается также, что клетки-эффекторы могут вызвать определенную деструкцию мишеней по типу CML.

В конечном итоге весь набор проб в тесте антителозависимок клеточно-опосредованной лимфоцитотоксичности следующий:

Мишени + эффекторы + испытуемая сыворотка (опытная проба);

Мишени (контрольная проба, т. е. спонтанное высвобождение 51 Cr);

Мишени + эффекторы (контрольная проба на активность эффекторов);

Мишени + испытуемая сыворотка (сывороточный контроль).

Лимфоциты выделяют обычным образом и ресуспендируют в RPMI-1640 + 10% эмбриональной телячьей сыворотки; обрабатывают суспензию карбонильным железом для удаления моноцитов; добавляют аммония хлорид или H 2 O для лизиса оставшихся эритроцитов;

В суспензию клеток-мишеней добавляют 51 Cr в форме р-ра Na 2 CrO 4 100 - 200µCi мл (3,7x10 6 - 7,4x106 БК/мл) и инкубируют 40 - 60 мин;

Клетки трижды отмывают в RPMI +0,1% HSA, ресуспендируют в той же среде и доводят до 2x10 8 в 1 мл; 50 µl суспензии меченых клеток помещают в пробирку и в дальнейшем подсчитывают изотопную активность на γ-счетчике для выявления полного изотопного "усвоения"; остальное раскапывают в лунки планшета по 50 µl суспензии (1x10 5 клеток на лунку);

Суспензия клеток-эффекторов доводится до 2x10 7 кл в 1 мл и в. каждую лунку помещают 50 µl суспензии (или 100 µl), соотношение эффекторов и мишеней 10:1 (или 20:1);

Инкубация продолжается 4 ч во влажной атмосфере термостата с 5% CO 2 (длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч);

Приготовляют в пробирках несколько разведений испытуемой сыворотки (1:25; 1:100) и добавляют в лунки до 50 µl каждого разведения: и неразведенную сыворотку; окончательная постановка теста выглядит, как показано в табл. 23.

Таблица 23

Постановка ADCC. Все варианты проб, µl

* (Вместо испытуемой сыворотки закапывают пул АВ-сывороток. )

** (Вместо испытуемой сыворотки закапывают моноспецифическую HLA-сыворотку, направленную против мишеней (не эффекторов). )

Инкубация панелей продолжается 4 ч во влажной атмосфере с 4% CO 2 ; длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч;

После инкубации половину объема из каждой лунки (100 μl) осторожно отсасывают автоматической пипеткой и помещают в пробирки для подсчета импульсации 51 Cr; активность подсчитывают на γ-счетчике;

Вычисления следующие:

% высвобождения 51 Cr = 2 × А оп - фоновая активность/В - фоновая активность × 100;

% цитотоксичности = А оп - А сп /100 - А сп × 100, где А оп - % высвобождения 51 Cr в опытных пробах; А сп - % спонтанного высвобождения; В - полное усвоение изотопа.

Как положительный результат рассматривается 5% и выше цитотоксичность после 4 ч инкубации.

СКЛ (смешанная культура лимфоцитов) - это тест, позволяющий определить степень распознавания иммунными системами супругов антигенов тканевой совместимости друг друга.

Один из видов клеток крови, лимфоциты — являются основой иммунной системы. При этом среди клеток лейкоцитов существует некая иерархия, есть главные клетки, есть подчиненные, из которых каждая выполняет свою функцию.

При встрече лимфоцита с любыми чужеродными для организма объектами (клетками другого организма, вирусами, бактериями, и т. д.), то развивается иммунный ответ. Степень силы иммунного ответа будет зависеть от сходства структуры антигенов тканевой совместимости (HLA- антигенов).

Иммунный ответ выражается в появлении клонов-потомков одной клетки, при этом это клетки, строго специализированные к конкретным чужеродным факторам, на которые необходим ответ. Иначе говоря, реакция иммунных клеток на что-то выражается том, что они начинают делиться. Деление клеток можно оценить по скорости синтеза ДНК. Чем больше синтезируется ДНК — тем интенсивнее делятся клетки, тем их больше, тем активнее идет развитие иммунного ответа. Интенсивность образования ДНК можно выявить путем включения в культуру клеток радиоактивного нуклеотида одного из «кирпичиков» ДНК, тимидина. Именно так и производится оценка смешанной культуры лимфоцитов.

Технически это можно сделать так. У обоих супругов берут кровь, из которой выделяют лимфоциты, которые затем помещают в благоприятную для деления питательную среду. При смешении лимфоцитов разных людей, они начинают друг на друга реагировать. Однако если просто зарегистрировать активность образования ДНК в смешанной культуре разных людей, невозможно понять, как реагирует конкретный человек на другого конкретного человека, потому что "воевать" начинают клетки всех тех людей, лимфоциты которых помещены в среду.

Для того, чтобы оценить индивидуальную реакцию, клетки одного из супругов подвергают воздействию, которое делает невозможным их деление. Однако антигенные свойства лимфоцитов при этом сохраняются. В таком случае вся активность клеток в культуре будет связана только с живыми клетками другого супруга. Сравнивая различные комбинации культур живых и лишенных способности активно действовать клеток, можно получить необходимую информацию о степени иммунологического сходства супругов.

Анализ предполагает исследование 12-ти различных культур, оценка реакции в которых проводится на 3-и и 5-е сутки.

В результате получают 24 цифры, дающие информацию о реакции конкретной женщины на антигены тканевой совместимости мужа в процессе имплантации и во время беременности.

Не только иммунное отторжение, но и иммунная защита беременности - активный процесс. Для развития иммунологической толерантности на первом этапе важно правильное иммунологическое распознавание ДНК мужа, содержащихся в зародыше. Если это распознавание вялое, медленное, происходит слишком поздно, тогда зародыш атакуется естественными клетками-киллерами матери и погибает.

Анализ СКЛ позволяет не только оценить состояние иммунологического распознавания лимфоцитов супругов друг другом, но и проконтролировать процесс лечения с помощью иммунизации лимфоцитами, выбрать метод и дозу иммунизации, оценить перспективы применения того или иного способа исправления ситуации. Поэтому после иммунизации анализ на СКЛ приходится повторять.

КАТЕГОРИИ