Гемоглобин повышен в крови у животных. Определение количества гемоглобина

ГЕМОГЛОБИН

Гемоглобин (Нв) – сложный белок (хромопротеид) - окрашивает эритроциты в красный цвет, состоит из белка глобина и четырех молекул гема. Гем является активной частьюи содержит двухвалентное железо, одна молекула гема способна присоединять и отдавать одну молекулу кислорода. Глобин является белковым носителем гема. Гемоглобин в легких присоединяет к себе кислород, образуя непрочное, легко диссоциируемое соединение – оксигемоглобин (НвО 2). Кровь, насыщенная оксигемоглобином (артериальная), поступает в ткани организма, где оксигемоглобин распадается на восстановленный гемоглобин и кислород. Восстановленный гемоглобин (дезоксигемоглобин) втканях соединяется с углекислым газом, образуя также непрочное соединение карбгемоглобин (НвСО 2). Кровь, насыщенная восстановленным гемоглобином и карбгемоглобином (венозная) поступает в малый круг кровообращения. В крови плода находится фетальный гемоглобин (НвF), который может значительно больше насыщаться кислородом, чем гемоглобин матери. Считается, что фетальный гемоглобин синтезируется в печени, а гемоглобин взрослых животных – в красном костном мозге. Гемоглобин легко вступает в соединение с угарным газом (окись углерода), образуя карбоксигемоглобин (НвСО), который утрачивает способность к переносу кислорода. Уже при содержании во вдыхаемом воздухе только 0,04% окиси углерода наступает тяжелое отравление, а при концентрации 0,1% – гибель животного. При слабом отравлении окись углерода постепенно отщепляется, и гемоглобин восстанавливает свою способность к присоединению и переносу кислорода. При действии на гемоглобин сильных окислителей (бертолетова соль, перекись водорода, анилин и др.) образуется достаточно прочное соединение гемоглобина с кислородом - метгемоглобин (МtНв), в котором двухвалентное железо переходит в трехвалентную форму. Это соединение прочно удерживает кислород и не может отщеплять его тканям. При образовании большого количества метгемоглобина наступает гибель животного от удушья. В животноводческой практике метгемоглобин образуется при скармливании животных кормов, содержащих большое количество нитратов от внесения в почву больших доз азотистых удобрений. Качественное определение гемоглобина и его производных можно провести при помощи спектрального анализа, а количественное – различными калориметрическими методами (табл. 7.).

Таблица 7.Соединение гемоглобина в крови животных г/л крови

Низкое содержание гемоглобина может наблюдаться при несбалансированном кормлении животных, нарушении синтеза гемоглобина, что приводит к значительным нарушениям многих функций организма.

Для установления насыщенности эритроцитов гемоглобином определяют цветовой показатель или индекс g .

В норме этот показатель равен 1 ± 0,15%

Миоглобин – это сложный белок, содержащийся в скелетных и сердечной мышцах. Миоглобин может связывать 14-15% общего количества кислорода. Кислород миоглобина используется мышцамипри их сокращении, когда приток крови в их капиллярах уменьшается. При расслаблении мышц миоглобин снова присоединяет к себе кислород. В значительно больших количествах миоглобин содержится в мышцах морских млекопитающих, что дает им возможность длительное время находиться под водой.

При разрушении эритроцитов гемоглобин распадается на гем и глобин, часть железа гема окисляется с образованием специфического соединения-гемосидерина, используемого для синтеза нового гемоглобина. Остальная часть гема превращается в желтые пигменты – билирубин и биливердин, которые в дальнейшем в виде уробилина и урохрома выделяются с мочой или в виде стеркобилина - с каловыми массами.

Послеродовая гемоглобинурия коров (Haemoglobinuria puerperalis) является у коров одной из форм гемолитической анемии; регистрируется она, как правило, в зимнее – стойловый период у высокопродуктивных коров 5-7- летнего возраста в первые 5 недель после отела и протекает с явлениями сильной гемоглобинурии. Эта болезнь особенно распространена в местностях, где отмечается недостаток фосфора в почве.

Этиология . Причины послеродовой гемоглобинурии у коров точно не установлены. Обычно ее появление связывают с погрешностями в кормлении и содержании, переохлаждении и интоксикации со стороны желудочно – кишечного тракта, длительным скармливанием корове больших количеств люцерны, свекловичного жома, свеклы и ее листьев при недостатке в рационе кормления фосфора и других необходимых животному минеральных солей (чаще бывает после засушливого лета).

Патогенез . У больной коровы быстро развивается гемолиз, сопровождающийся накоплением в плазме гемоглобина. Гемоглобин в незначительном количестве утилизируется в печени и селезенке, основная же часть его выделяется с мочой, приводя к развитию у животного гемоглобинурии. В дальнейшем у коровы происходит развитие уробилиновой желтухи. Понижение способности крови поглощать кислород и углекислоту из-за недостатка в эритроцитах гемоглобина вызывает у животного кислородное голодание и ацидоз.

Разрушенные эритроциты и растворенный в крови гемоглобин, становятся для организма больной коровы чужеродными веществами, вызывают проявления парентерального распада белка и сопровождаются повышением температуры тела и поражениями паренхиматозных органов.

Склеивание и распад эритроцитов приводит к закупорке кровеносных капилляров, с последующим развитием дегенеративных изменений в тканях, особенно к интралобулярным некрозам в печени. Нарушения функции печени, развивающаяся гемолитическая анемия вызывает у коровы тяжелое нарушение всех обменных процессов, которые в конечном итоге приводят к гибели коровы.

Патологоанатомические изменения . При вскрытии павших коров находим выраженную анемичность и желтушность тканей. Кровь жидкая, окрашена в коричневый цвет. Печень, селезенка и почки увеличены в размерах, находятся в состоянии жирового перерождения. При вскрытии печени отмечаем интралобулярные некрозы. На эпикарде – кровоизлияния, перерождение сердечной мышцы, в кишечнике-геморрагии.

Клинические признаки . Первые признаки послеродовой гемоглобинурии у коров иногда появляются в связи с родами и проявляются симптомами угнетения, умеренной лихорадкой (39-39,8° С иногда до 42°С), у коровы понижается аппетит, становится апатичной, появляются симптомы гипотонии преджелудков, наступает расстройство функции кишечника и снижение молочной продуктивности. После начала заболевание, через 1-2дня моча у коровы становится темно-вишневого цвета, прозрачной, сиропообразной и имеет щелочную реакцию. При исследовании мочи в ней обнаруживается белок, гемоглобин, уробилин, в отдельных случаях кетоновые тела, в осадке – продукты распада эритроцитов, клетки почечного эпителия, иногда почечные цилиндры. При исследовании крови в первые дни заболевания регистрируем резкое снижение количества эритроцитов (до 1,2 – 1,5 млн. в 1мм³) и гемоглобина (до 16% по Сали). Цветной показатель выше единицы (1,15); осмотическая резистентность эритроцитов понижена; СОЭ несколько ускорено. В мазках из периферической крови находим анизопойкилоцитоз, полихроматофилию, ретикулоциты (20: 1000), эритроциты с базофильной пунктацией и отдельные нормобласты. Общее количество лейкоцитов у большинства больных коров бывает в норме или же возрастает до 15 – 20 тыс. в 1мм³. Лейкоформула характеризуется нейтрофилией (до 72%) и выраженным регенеративным сдвигом. Отмечаем тромбоцитоз. При тяжелом течении послеродовой гемоглобинурии коров количество лейкоцитов в крови снижается до 4-5 тыс. в 1мм³. В сыворотке крови отмечаем повышенное содержание непрямого билирубина и появление метгемоглобина, выраженную гипофосфатемию, у отдельных больных коров снижение уровня каротина и щелочного резерва.

При послеродовой гемоглобинурии коров происходит нарушение показателей костномозгового пунктата. При остром течении болезни количество ядерных элементов в костном мозге увеличивается на 20-30%. Эритробластограмма характеризуется увеличением процента молодых эритробластических форм – проэриттробластов и базофильных эритробластов при уменьшении процента нормобластов. При этом количество гранулофилоцитов больше нормы в 10раз. Одновременно с регенеративными процессами в костном мозге больной коровы отмечаются явления дегенеративного порядка, которые сопровождаются пойкилоцитозом, анизоцитозом, комковатостью структуры протоплазмы эритроцитов и пикнозом ядер части эритробластов.

Неполноценный эритропоэз поддерживает гемолиз эритроцитов и замедляет процесс восстановления крови у больной коровы.

При рассмотрении миелограммы отмечаем уменьшение готовых резервов миелобластов и ретикулоэндотелиальных клеток.

При смене абсолютной нейтрофилии относительной, происходит нарастание нейтрофилов влево, среди гранулоцитов обнаруживаются лизис и вакуолизация ядра и протоплазмы.

При клиническом осмотре больной коровы отмечаем бледность и умеренную желтушность видимых слизистых оболочек. При перкуссии отмечаем увеличение зоны печеночного притупления, глубокой пальпацией устанавливаем болезненность печени. При аускультации сердца – тоны сердца усилены, при пальпации сердечный толчок стучащий. Пульс ускорен — доходит до 100-120 ударов в минуту. Дыхание – затруднено и учащено (30-40 и более в минуту). В выдыхаемом воздухе иногда ощущаем запах ацетона. Кал становится жидким, со слизью, имеет гнилостный запах. Молоко у отдельных животных имеет красноватую окраску.

Течение болезни острое. В тяжелых случаях заболевание может продолжаться в течение 3-5 дней. При благоприятном исходе заболевания нормализация состава крови и улучшения общего состояния больной коровы происходит в течение 1-2 месяцев. У ранее переболевших послеродовой гемоглобинурией коров заболевание может повторится.

Диагноз . Диагноз на послеродовую гемоглобинурию коров ставят на основании того, что:

• заболевают в основном высокопродуктивные коровы в первые недели после отела;
• у больных животных лабораторными методами устанавливаем гемолитическую анемию с гемоглобинурией;
• болезнь регистрируется чаще всего в зимне – стойловый период содержания животных (с ноября по апрель месяц).

Дифференциальный диагноз . При постановке диагноза на послеродовую гемоглобинурию ветврач должен исключить гемоспоридиозные заболевания, отравления растительными и минеральными ядами.

Лечение . Заболевшим коровам владельцы должны предоставить теплые, сухие помещения, в которых отсутствует сквозняк. Из рациона кормления животных немедленно исключают недоброкачественные корма (промерзлые, загнившие, заплесневевшие, силос с большим содержанием масляной кислоты и т.д.). Переводим на диетическое кормление, состоящее из кормов, богатых растительным белком, углеводами и каротином, из минеральных веществ – обеспечиваем достаточным количеством фосфора. В качестве минеральной фосфорной подкормки в рацион включаем натрийфосфат двузамещенный в дозе 50г в сутки. Для предупреждения возникновения у больной коровы дегенеративных изменений в почках больным коровам необходимо давать обрат или молочную сыворотку в количестве 5-10 литров в день. Для повышения резистентности организма и нормализации обменных процессов внутримышечно вводим тетравит в дозе 10мл, селевит и т.д.

Для снятия ацидоза и нейтрализации токсинов, образующихся в преджелудках, корове внутрь дают 80-100г натрия гидрокарбоната в виде 5-10% -ного раствора два раза в день, в течение 3-4 дней.

Внутривенно вводим 20-40% -ные растворы глюкозы по 150-200мл, 2мг строфантина,20-30 мл метапирина в расчете примерно на 500кг живой массы. Такое лечение проводят ежедневно до заметного улучшения общего состояния коровы. Для поддержания функции печени можно назначать препараты метионина, витамины В12 и Е Для поддержания сердечной деятельности подкожно вводим 4-5г кофеина в 20%-ном растворе 2-3 раза в сутки в течение 3-5 дней.

При дефиците в организме фосфора, его вводят: парентерально (урзолит, 500мл/500кг массы тела) или орально (50 г динатрий –фосфата или 250 г рахитина).

Для стимуляции гемопоэза назначаем переливание совместимой крови (до 4л) одновременно с назначением внутрь препаратов железа и меди, внутримышечно железодекстриновые препараты. В период выздоровления назначаются внуримышечные инъекции камполона (0,05 – 0,08 мл на 1кг массы тела) с промежутком в 8-14 дней, витогепад.

Профилактика . Профилактика послеродовой гемоглобинурии коров строится на сбалансированном рационе кормления глубокостельных и новотельных коров. Рационы должны быть полноценными в белковом, углеводном, витаминном и минеральном отношении, содержать достаточное количество фосфора и правильным его соотношением с кальцием. Коровам в последний месяц беременности не следует скармливать в большом количестве сахарную свеклу и ее продукты. В рацион ежедневно нужно добавлять по 150-200г минеральной смеси, содержащей большое количество фосфора. В зимне – стойловый период животные должны пользоваться активным моционом.

Количество гемоглобина можно определить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путем измерения красящей способности крови (колориметрически).

Для клинических целей используется последний метод, который требует небольшого количества крови и дает возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространенным является метод Говерса в видоизменении Сали.

Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определенной концентрации, взятом в качестве стандарта. Процент гемоглобина в этом случае определяется колориметрически.

Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того, что стандартная жидкость довольно быстро выцветает, в последнее время выпущены стандарты из цветного стекла, окрашенные под цвет солянокислого гематина металлическими окислами. Эти стандарты не выцветают даже под действием прямого солнечного света.

Между стандартными пробирками помещается пробирка, имеющая деления от 10 до 140 или от 10 до 170 такого же диаметра, как и первая. Пробирка с делением от 10 до 140 предназначена для определения гемоглобина в единицах Сали, а от 10 до 170-в процентах.

Подставка, в которой помещаются стандартные и градуированные пробирки, представляет собою деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для них. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое дает рассеянный свет; на его фоне резко оттеняется окраска стандарта и испытуемой сыворотки.

Для взятия крови прилагается капиллярная пипетка с меткой 20 мм, которая определяет количество крови, взятой для исследования.

Кроме гемоглобинометра, для определения гемоглобина необходимо иметь N/10 раствор НС1 и дистиллированную воду.

Техника определения следующая. В градуированную пробирку до метки 20 набирается N/10 раствор НС1, затем в капилляр до метки 20 мм3 насасывается кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят ее в пробирку

С соляной кислотой. Кровь осторожно выдувают в А710 раствор соляной кислоты, содержимое пробирки из верхнего прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку.

Капилляр промывается 2 или 3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость постепенно становится коричневой. Спустя 5-7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают прибавлять дистиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по мере изменения цвета и приближения его к стандарту,-то одной капле. Кровь смешивается или стеклянной палочкой с утолщением на конце или же покачиванием прсбирочки. Необходимо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась.

Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учет ведется по нижнему мениску жидкости. Допустимой ошибкой при вторичном исследовании той же самой крови считается расхождение в пределах пяти делений. Метка 80 на пробирке с делением до 140 и цифра 100 на пробирке с делением до 170 соответствует 16,0-17,0 гемоглобина в 100 мл крови. Чтобы получить абсолютную цифру, показывающую количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови, необходимо показания гемометра в процентах Сали умножить на 0,17, а количество в единицах- на коэффициент 0,2125.

Количество гемоглобина у здоровых животных колеблется в следующие пределах (см. табл. на стр. 418).

Колебания гемоглобина зависят от возраста, пола, породы, характера кормления и некоторых других условий. При патологических процессах количество гемоглобина может быть увеличено и уменьшено по сравнению с нормальными показателями.

Увеличение количества гемоглобина носит название плейохромии. Она может возникнуть вследствие сгущения крови при потере жидкости организмом (понос, рвота, потливость), при образовании экссудатов и транссудатов, Плейохромию отмечают при кровепятнистой болезни лошадей, интоксикациях и отравлениях. Повышение количества гемоглобина отмечается при физическом напряжении лошади. При хорошей подготовке (тренировка) количество гемоглобина остается почти без изменений.

Уменьшение гемоглобина (олигохромемия) встречается довольно часто и особенно при заболеваниях, связанных с анемией. Олигохромемия является симптомом острых и хронических заболеваний, различных по своему происхождению.

Олигохромемия связана с уменьшением общего количества эритроцитов или обеднением эритроцитов гемоглобином. Следовательно, олигохромемия определяет не только степень, но и характер анемии. Необходимо, однако, учесть, что правильная оценка может быть сделана только при условии подсчета эритроцитов и определения величины цветного показателя.

Определение цветного показателя. Цветной показатель дает представление об отношении гемоглобина к красным кровяным тельцам. Метод определения цветного показателя основан на сравнении. Если в норме цветной показатель равен примерно единице, то изменение этой цифры в сторону увеличения или уменьшения рассматривается, как весьма важный показатель нарушения соотношения между эритроцитами и гемоглобином.

У животных определение цветного показателя проводится по формуле:

Гемоглобин 2 Эритроциты 2 Гемоглобин 2 х эритроциты 1

Гемоглобин 1 / эритроциты 1 = гемоглобин 1 x эритроциты 2

Где гемоглобин 1 и эритроциты 1 показывают среднее количество гемоглобина и эритроцитов у здорового животного и гемоглобин 2 и эритроциты 2-найденное количество гемоглобина и эритроцитов у исследуемых животных. Если у лошади взять за норму количество гемоглобина 75, а эритроцитов 7 500 000, то цветной показатель будет равен единице. Всякое отклонение в количестве гемоглобина и эритроцитов поведет к изменению цветного показателя. Необходимо учитывать только такие отклонения от нормы, которые превышают 15%. Небольшие отклонения учитывать не следует.

Определение цветного показателя имеет значение в дифференциации анемий. При постгеморрагических анемиях, когда имеется одновременно уменьшение как количества эритроцитов, так и гемоглобина, цветной показатель приближается к единице; ниже единицы цветной показатель бывает при вторичных анемиях, при которых снижается количество гемоглобина, при почти нормальном или слегка сниженном количестве эритроцитов; выше единицы цветной показатель отмечается при гемолитических анемиях, когда в ток крови выбрасывается значительное количество молодых клеток (повышенная регенерация).

Для суждения о средней насыщенности эритроцитов гемоглобином практически можно использовать определение кровяного числа. Оно получается делением найденного количества гемоглобина на число эритроцитов в миллионах, например:

75% / 7(000000) = 11 или 90% / 10(000000) =9

Величина кровяного числа неодинакова у различных животных и зависит от количества эритроцитов и гемоглобина в норме, но в среднем она приближается к 10.

ЗАНЯТИЕ 17. Получение крови, определение скорости оседания эритроцитов и ретракции кровяного сгустка

Место проведения занятия-клиника и лаборатория.

Цель занятия:

Овладеть техникой взятия крови у животных.

Научиться определять скорость оседания эритроцитов и ретракцию кровяного сгустка.

Показатели СОЭ у разных видов животных и отклонения.

Показатели индекса ретракции кровяного сгустка у лошади и крупного рогатого скота и при патологии.

Для получения большого количества крови её берут у КРС, овец, коз, лошадей из яремной вены с помощью кровопускательных игл, у свиней-из хвоста, хвостовой артерии и крониальной полой вены.

Небольшое количество крови можно получить у животных из кровеносных сосудов уха, у кур-из гребня или серёжек.

Определение скорости оседания эритроцитов

по Неводову

В эритроседиометр отвешивается 0,04 г натрия цитрата в порошке, затем набирают в него крови до «0» из яремной вены (предварительно подготовив поле). Осторожно переворачивают эритроседиометр до полного растворения порошка. Если крови больше «0», то излишек отсасывают пипеткой. Установив пробирку в штатив, наблюдают за ходом реакции через каждые 15 минут в течение часа, затем отмечают через 24 часа.

По Панченкову

В капилляр, после промывания свежеприготовленным 5 % раствором лимоннокислого натрия, набирают того же раствора до метки Р или до деления 50 и выпускают на часовое стекло или в пробирку, затем дважды набирают кровь до метки «К» или дел. 100 и выпускают на то же часовое стекло или в пробирку, смешивают и смесь набирают без пузырьков воздуха в другой, промытый лимоннокислым натрием,капилляр, который устанавливают в штатив и наблюдают за ходом реакции. Учитывают СОЭ через 1 час и выражают в миллиметрах.

У здоровых животных показатели за час составляют: у КРС-0,5-1,5; у овец-0,5-1,0; у лошадей-40-70; у свиней-2-9; у собак-2-6; у кур-2-3 мм.

Определение ретракции кровяного сгустка

по П. В. Каймакову

Кровь в количестве 10 мл набирают в хорошо вымытую и очищенную спиртом и эфиром сухую пробирку и отстаивают 24 часа при комнатной температуре.

По истечении 24 часов отстоявшуюся сыворотку отсасывают пипеткой и измеряют её количество в мерной пробирке, после чего определяют индекс ретракции (И.Р.) путём деления количества сыворотки на первоначальный объём крови.

Пример: крови взято 10 мл, а сыворотки 5 мл

И. Р. 10 = 0,5

И. Р. у лошади колеблется от 0,3 до 0,7 в среднем-0,53

У КРС равен 0,4-0,6.

Результаты исследования.

Показатели скорости оседания эритроцитов:

через 15 минут

через 30 минут

через 45 минут

через 1 час

через 24 часа

Индекс ретракции кровяного сгустка

Заключение

Учебное оборудование, демонстрационный материал, животные

Пробирки Неводова или эритроседиометры

Аппарат Панченкова

Натрий цитрат

5 % раствор натрия цитрата

Пробирки диаметром 1,5 см

1. Иглы для взятия крови

2. Настойка Йода

   Спирт-эфир

   Таблицы с показателями СОЭ и ИР у животных

Животные: КРС, лошади, поросята

VIII. Оценка выполненной работы студента преподавателем.

ЗАНЯТИЕ 18. Подсчёт количества эритроцитов, определение гемоглобина в крови и цветового показателя

Место проведения занятия-клиника, лаборатория.

Цель занятия-освоить методики подсчёта эритроцитов и определения гемоглобина.

Текущий опрос студентов по следующим вопросам:

Показатели эритроцитов и гемоглобина у разных видов животных.

Их отклонения при различных физиологических и патологических состояниях.

Объяснение методики выполнения работы преподавателем.

Выполнение работы студентами.

Подсчёт количества эритроцитов.

Кровь набирают в смеситель до метки 0,5 или 1. Конец меланжера обтирают от крови, затем в капилляр до метки 101 набирают физиологический раствор. Получается разведение в 200 или 100 раз. Когда смеситель наполнен кровью и физиологическим раствором, концы его зажимают между большим и указательным пальцами и несколько раз энергично встряхивают.

Перед заряжением камеры содержимое смесителя вновь тщательно перемешивается и вводится под покровное стекло. Чтобы высота камеры не изменялась, необходимо покровное стекло плотно протереть до образования т.н. ньютоновских колец.

Заряженная камера помещается под микроскоп без иммерсии. Подсчёт эритроцитов начинают с квадрата, расположенного в левом углу, затем переходят к другим квадратам.

Подсчитывать нужно в 5 больших квадратах все эритроциты, лежащие внутри квадрата, и на его внутренних линиях.

Подсчитанные эритроциты в пяти больших квадратах суммируют и определяют содержание количества эритроцитов в 1 куб. мм. крови по следующей формуле: М . 4 000 . у

Количество эритроцитов Х равно количеству подсчитанных клеток в пяти больших квадратах М. умноженному на 4 000 и степень разведения у, разделённому на 80 (число малых квадратиков).

Объём одного малого квадратика равен 1\ 4 000 куб. м., а поэтому, чтобы получить количество в 1 куб. мм. необходимо число эритроцитов умножить на 4 000.

Расчёт нужно производить следующим образом: количество эритроцитов в 5 квадратах умножается на 10 000 при разведении на 200 и

на 5 000 при разведении на 100.

Пробирочный метод подсчёта эритроцитов.

В чистую пробирку Флоринского наливают 4 мл физраствора. Кровь набирают в пипетку от гемометра Сали 0,02 мл, осторожно выдувают в пробирку с физраствором, промывают пипетку, закрывают пробкой и тщательно перемешивают. Разведение 1:200.

Кровь, взятую в пробирку перед заполнением камеры, встряхивают несколько раз. Камеру заполняют с помощью пастеровской пипетки или концом круглой стеклянной палочки, важно, чтобы вся поверхность, на которой нанесена сетка, была заполнена жидкостью. Расчёт производят обычным способом с учётом разведения.

В связи с переходом к применению в клинической лабораторной диагностике Международной системы единиц СИ в практикуме наряду со старыми физическими единицами приведены также новые единицы. Например: вместо выражения количества эритроцитов в млн/мкл и лейкоцитов в тыс/мкл число эритроцитов следует обозначать в 10 12 л, а лейкоцитов-в 10 9 л.

Количество эритроцитов у взрослых здоровых животных в млн/мкл или 10 12 л;

КРС 4,5-7,5; овцы-7,6-11,2; лошади-5,5-9,0; свиньи-4,0-7,5; собаки-5,2–8,4; куры-2,5–5,0.

Определение гемоглобина. Способ Сали

В градуированную пробирку при помощи пипетки отмеряют до 10-го деления или до круговой метки с цифрой 2 гр проц. децинормального раствора соляной кислоты. В капилляр до 20 мм набирают кровь и осторожно, очистив конец капилляра переносят кровь в пробирку с децинормальным раствором НСl, чтобы на стенках капилляра не осталось следов крови, ещё раза три споласкивают той же кислотой стараясь не пенить жидкость.

Кровь гемолизируется и образуется соляно-кислый гематин.

Спустя 5-7 минут в пробирку добавляют дистиллированной воды. Доводя окраску до стандарта.

Цифра, соответствующая уровню жидкости по нижнему мениску в пробирке, показывает количество гемоглобина по Сали или г\100 мл.

Определение цветового показателя

Цветовой показатель вычисляется по формуле:

где ЦП-цветовой показатель;

Н1-среднее количество гемоглобина в норме, г в 100 мл (или г \ л);

Н2-количество гемоглобина у исследуемого животного, г в 100 мл (или г \л);

Е1-среднее количество эритроцитов в норме млн \ мкл (или 10 12 \л);

Е2-количество эритроцитов у исследуемого животного, мдн\мкл

(или 10 12 \л).

Цветовой показатель крови у здоровых животных составляет: у КРС-0,7-1,1; у овец-0,5-0,7; у лошадей-0,8-1,2 у свиней-0,8-1,0; у собак-0,8-1,2; у кур-2-3.

Результаты определения:

Эритроциты.

Гемоглобин.

Цветовой показатель.

Заключение.

Микроскоп.

Счётная камера Горяева.

Смеситель для эритроцитов.

Физиологический раствор.

Покровные стёкла.

Гемоглобинометр Сали.

Дистиллированная вода.

Децинормальный раствор соляной кислоты.

Пипетки градуированные на 1 и 5 мл, пипетки от гемометра Сали.

Таблицы с показателями эритроцитов и гемоглобина у животных.

Животные: КРС, лошади, поросят.

ЗАНЯТИЕ 19.Подсчёт количества лейкоцитов. Приготовление и окраска мазков. Выведение гемограммы, гематологического и лейкоцитарного профиля

Место проведения занятия-клиника и лаборатория кафедры.

Цель занятия:

Освоить методику подсчёта лейкоцитов.

Приобрести навыки приготовления и окраски мазков.

Вывести лейкоцитарные формулы разных видов животных.

Определить лейкоцитарный профиль у крупного рогатого скота.

Текущий опрос студентов по следующим вопросам:

Показатели лейкоцитов у разных видов животных.

Их изменения в зависимости от некоторых физиологических и патологических состояний.

Понятие о лейкоцитарной формуле и лейкоцитарном профиле.

Показатели лейкоцитарной формулы у крупного рогатого скота и лошадей.

Морфологические изменения лейкоцитов.

Объяснение методики выполнения работы преподавателем.

Выполнение работы студентами.

Подсчёт количества лейкоцитов.

Кровь набирают в смеситель или меланжер до черты 0,5 или 1 (из уха или цитратной крови). Затем в этот же меланжер набирают 2% раствор уксусной кислоты до метки 11, получается разведение в 20 раз. После тщательно перемешивают, первые две капли удаляют из смесителя и каплю средней величины вводят под покровное стекло к камере (ранее притёртое). Критерием притёртости стекла к камере служит образование ньютоновских колец. Правило подсчёта-заряженная камера помещается под микроскоп без иммерсии. Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах (т.е. 1600 малых). Допустимо считать 75 больших квадратов (т.е. 1200 малых).

а х 4000 х в

Формула для подсчёта: Х =

где Х-искомое количество форменных элементов в 1 м 3 ;

а-сумма форменных элементов, сосчитанных в определённом объёме камеры;

б-количество сосчитанных малых квадратов;

в-разведение крови.

Объём малого квадрата равен 1\100 мм 3 , то в 1 мм 3 крови их будет в 400 раз больше.

Пример: (разведение крови в 20 раз).

В 1600 малых квадратах (т. е. 100 больших) сосчитано 150 лейкоцитов, тогда в 1 м 3 будет:

150 х 4000 х 20

1600 = 150 х 50 = 7500

т.е. сумму лейкоцитов, сосчитанных в 100 больших квадратах, надо умножать на 50.

Подсчёт лейкоцитов (пробирочный метод)

В чистую пробирку отмеривают пипеткой 0,4 мл раствора уксусной кислоты. Кровь набирают пипеткой от гемометра Сали-0,02 мл и осторожно переносят её в пробирку с 3 % уксусной кислотой. Разведение 1:20. Камеру заполняют с помощью пастеровской или концом круглой стеклянной палочки, важно, чтобы вся поверхность сетки была заполнена жидкостью. Расчёт производят обычным способом с учётом разведения.

Количество лейкоцитов у взрослых здоровых животных (тыс.\мкл или 10 9 \л); у КРС-6,5-9,5; у овец-6,6-10,6; у лошадей-7,0-12,0; у свиней-6,7-23,0; у собак-8,5-10,5; у кур-20,0-40,0.

Выведение лейкоцитарной формулы .

Подсчёт отдельных классов лейкоцитов ведётся под микроскопом с иммерсией. Всего в мазке должно быть подсчитано не менее 100 клеток, лучше 200. Существуют методы подсчёта по Меандру-4-х полюсный и по Мухину (три линии перпендикулярные мазку в его центре).

Лейкограмма крови здоровых животных, %

Нейтрофилы

Животные Б Э М Ю П С Л М

*) Псевдоэозинофилы.

Определение лейкоцитарного профиля.

Лейкоциты подсчитываются по классам на базе 100 клеток, выводится лейкоцитарная формула, после чего производится перерасчёт по количеству лейкоцитов в мм 3 .

Пример: если на 100 сосчитанных клеток приходится 60 лимфоцитов, а общее количество лейкоцитов в 1 мм 3 равно 10 000, то по формуле:

100-60 10 000 х 60

10 000- Х Х = 100 = 6 000

Затем пересчитываются другие классы.

Полученные данные отмечают точкой в соответствующей графе специального бланка.

Соединив точки линией, получают графическое изображение-лейкоцитарный профиль. Он даёт возможность определить какой лейкоцитоз у животного относительный или абсолютный.

Результаты исследования.

Показатели лейкоцитарной формулы и патологические

изменения лейкоцитов.

I. Лейкоциты (тыс.\ мкл.):

базофилы %;

эозинофилы %;

миелоциты %;

• палочкоядерные %;

  сегментоядерные %;

  лимфоциты %;

  моноциты %;

  клетки Тюрка %.

Патологические изменения:

анизоцитоз;

пойкилоцитоз;

Определение лейкоцитарного профиля.

Определение гематологического профиля

Заключение

Учебное оборудование, демонстрационный материал, животные:

Микроскоп

Счётная камера Горяева

Меланжеры для лейкоцитов

Шлифованное покровное стекло.

2-3 % раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовой синькой.

Пробирки лабораторные с резиновыми пробками

Пипетки градуированные на 1 и 5

Пипетки от гемометра Сали

Предметное стекло (чистые, обезжиренные)

Шлифованные стёкла

Краска Романовского-Гимза

Дистиллированная вода

Эмалированные ванночки

Иммерсионное масло

Таблицы с показателями лейкоцитарной формулы, лейкоцитарного и гематологического профиля.

VIII. Оценка работы студента преподавателем.

ЗАНЯТИЕ 20. Определение общего кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови

Цель занятия-научиться определять в сыворотке крови количество кальция и неорганического фосфора и давать клиническую оценку результатам исследования.

Текущий опрос студентов по следующим вопросам:

Физиологическая роль кальция в организме животного.

Показатели общего кальция в сыворотке крови у различных видов сельскохозяйственных животных и их изменения.

Физиологическая роль фосфора в организме животных.

Показатели неорганического фосфора в сыворотке крови у сельскохозяйственных животных и их изменения

Объяснение методики выполнения работы преподавателем.

Выполнение работы студентами.

Определение кальция в сыворотке крови по методу де-Варда .

В одну маленькую центрифужную пробирку помещают 0,5 мл сыворотки крови, в другую-0,5 мл дистиллированной воды. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл насыщенного водного раствора щавелевокислого аммония.

Через 30 минут пробирки центрифугируют в течение 15 минут. Сыворотку отсасывают, к осадку добавляют 1-2 мл дистиллированной воды и вновь центрифугируют 3-5 минут.

После этого жидкость отсасывают, к осадку приливают 0,3 мл серной кислоты в разведении 1: 2 с водой. Смесь нагревают на водяной бане до 50-65% и титруют сантинормальным раствором перманганата (КМпО4) до появления розового окрашивания, сохраняющегося в течение 2 минут.

Количество кальция в миллиграммах-процентах вычисляют по формуле: (а - к) х 2 х 0,2 х 100, где

а - количество сантинормального раствора перманганата, израсходованного на титрование сыворотки;

к - количество перманганата, израсходованного для контрольной титрации дистиллированной воды;

0,2 - количество кальция в миллиграммах, соответствующее 1 мл сантинормального раствора перманганата;

2 - множитель для вычисления количества кальция в 1 мл сыворотки крови;

100 - множитель для вычисления количества кальция в миллиграмм-процентах в 100 мл сыворотки крови.

Количество общего кальция (мг на 100 мл) у КРС 10,1-12,5; у лошадей-12,0-15,щ; у свиней-10,5-12,5; у птиц-11,0-15,0.

Определение неорганического фосфора в сыворотке крови

по Аммону и Гинсбергу (в модификации С.А. Ивановского).

В центрифужную пробирку вносят 3 мл дистиллированной воды, 1 мл исследуемой сыворотки и 1 мл 20 % раствора трихлоруксусной кислоты, хорошо смешивают. Через 5 минут центрифугируют при 3 000 об\мин. в течение 15 мин. (или фильтруют через бензольный фильтр). Затем в пробирку наливают 2,5 мл прозрачного центрифугата (или фильтрата), 0,5 молибденового реактива, 1 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты и 6 мл дистиллированной воды. Одновременно в другую пробирку (стандарт) вносят 3 мл рабочего стандартного раствора фосфора, 0,5 мл молибденового реактива, 1 мл 1 % раствора аскорбиновой кислоты и 5,5 мл дистиллированной воды. Через 10 минут жидкости в обеих пробирках колориметрируют на фотоэлектроколориметре при зелёном светофильтре в кюветах шириной 10 мм.

Расчёт производят по формуле:

Ех х 0,05 х 100 Ех х 10

Х = Ек х 0,5 Ек, где

Х - количество неорганического фосфора в исследуемой сыворотке крови, мг в 100 мл;

Ех - оптическая плотность пробы с центрифугатом сыворотки;

Ек - оптическая плотность пробы со стандартным раствором фосфора (стандарт);

0,05 - количество фосфора во взятом для анализа объёме рабочего стандартного раствора фосфора, мг; 100-коэффициент для перечисления количества фосфора на 100 мл сыворотки крови.

В сыворотке крови взрослых животных в норме содержится следующее количество неорганического фосфора (мг на 100 мл); у КРС-5,0-6,5; у свиней-7,7-9,5; у лошадей-5,1-6,0; у птицы-5,6-8,0; у овец-4,5-7,5.

Результаты.

Количество кальция (мг %).

Количество неорганического фосфора (мг. %).

Заключение.

Учебное оборудование, демонстрационный материал.

Реактивы: насыщенный водный раствор щавелевокислого аммония,

сантинормальный раствор перманганата калия, серная кислота в разведении 1:2, 20 % раствор трихлоруксусной кислоты; молибденовый реактив (готовят смешиванием раствора, состоящего из 5 г молибдата аммония и 60 мл дистиллированной воды, с раствором, приготовленным из 15 мл концентрированной Н2 SO4 и 25 мл дистиллированной воды); 1% раствор аскорбиновой кислоты на 0,1 н растворе НСl; основной стандартный раствор фосфора (4,394 г КН 2 РО 4) высушенного до постоянной массы над НSO в эксикаторе и дистиллированной воды до 1 л); рабочий стандартный раствор фосфора (2 мл основного раствора и дистиллированной воды до 100 мл + 20 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты; в 3 мл раствора содержится 0,5мг фосфора; вода дистиллированная).

Пробирки.

Градуированные пипетки.

Бензольные фильтры.

1. Фотоэлектроколориметр.

2. Сыворотка крови.

   Водяная баня.

   Термометр химический.

   Центрифуга.

Оценка работы студента преподавателем.

ЗАНЯТИЕ 21. Определение кислотной ёмкости и каротина в сыворотке крови

Место проведения занятия-лаборатория кафедры.

Цель занятия:

Овладеть методикой исследования кислотной ёмкости крови.

Научиться определять каротин в сыворотке крови и давать диагностическую оценку результатам анализов.

Текущий опрос студентов по следующим вопросам:

Что такое кислотная ёмкость и нормальные показатели кислотной ёмкости у различных видов сельскохозяйственных животных.

Виды нарушений кислотно-щелочного равновесия.

Физиологическая роль каротина, содержание его у животных в норме и при патологии.

Объяснение методики выполнения работы преподавателем.

Выполнение работы студентами.

Определение резервной щёлочности сыворотки крови

по И.П. Кондрахину.

Посуда: спаренные колбы, пипетки.

Реактивы:

0,01 н раствор NаОН (едкий натр);

5% раствор Н2SО4;

1 % спиртовой раствор фенолфталеина;

0,01 н раствор Н2SО4 (серной кислоты).

Ход исследования. В одну половину колбы вносят 0,5 мл сыворотки (или плазмы крови), причём выдувание остатков жидкости из пипетки не допускается, плотно закрывают пробкой. Во вторую половину колбы берут 2 мл 0,01 н раствора едкого натра и закрывают пробкой. Затем открывают первую половину колбы и к находящейся там сыворотке крови добавляют 1 мл 5 % раствора серной кислоты и быстро закрывают пробкой. Вращательными движениями тщательно смешивают сыворотку с кислотой. За время прохождения реакции смешивание повторяют 3-4 раза.

В контрольную пробирку вносят 2 мл 0,01 н раствора едкого натра и плотно закрывают пробкой. Во вторую половину спаренной колбы берут 1 мл 5% раствора серной кислоты и закрывают пробкой. Перед закрытием отверстий колбы пробки увлажняют дистиллированной водой.

Для большей точности каждый образец сыворотки исследуют в двух спаренных колбах. Контрольный опыт проводят в трёх сдвоенных колбах.

Через 4-6 ч (допустимо до 12 ч.) открывают колбы. В которых находится раствор едкого натра, вносят одну каплю 1 % спиртового раствора фенолфталеина. Смешивают (появляется красная окраска). Затем жидкость в колбе титруют 0,01 н раствором серной кислоты до полного обесцвечивания, что происходит при рН 8.Титрование следует проводить осторожно и с одинаковой быстротой во всех пробах и контроле.

Расчёт проводят по формуле:

Х = (а - 6) х 0,224 х 200 = (а - 6) х 44,8

где: Х-резервная щёлочность (в объёмных процентах) СО;

а-количество 0,01 н раствора серной кислоты, израсходованное на титрование опытной пробы, мл;

б-количество 0,01 н раствора серной кислоты, израсходованное на титрование опытной пробы, мл;

0,224-фактор пересчёта 0,01 н раствора серной кислоты на СО при данной реакции;

200-коэффициент для пересчёта взятого для анализа количества сыворотки (плазмы) крови (0,5 мл на 100 мл.)

Нормальные показатели кислотной емкости крови (мг в 100 мл); КРС-460-540, овцы-460-540, козы-380-520, лошади-500-600, свинья-500-600, собаки-450-550.

Определение каротина в сыворотке крови

(по В.Ф. Коромыслову и Л.А.Кудрявцевой)

В пробирку вносят 1 мл сыворотки крови и 3 мл 95 % этилового спирта, тщательно смешивают стеклянной палочкой, добавляют 6 мл петролейного эфира, энергично встряхивают в течение 2 минут и осторожно по стенке пробирки приливают 0,5 мл дистиллированной воды, оставляют стоять до чёткого разделения водной и органической фаз. После этого осторожно сливают 4,5 мл экстракта каротина и переносят в кювету.

Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах 1см при синем светофильтре против петролейного эфира (бензина). Одновременно колориметрируют рабочий стандартный раствор бихромата калия (5 мл дистиллированной воды смешивают с 5 мл основного бихромата калия).

Расчёт делают по формуле: А

где: Х-количество каротина в сыворотке, мг на 100 мл;

А-оптическая плотность исследуемой пробы;

Б-оптическая плотность рабочего стандартного раствора

бихромата;

1,248-коэффициент для перечисления каротина в мг на 100 мл сыворотки крови.

Результаты исследования.

1. Показатели кислотной ёмкости сыворотки крови.

Заключение.

Учебное оборудование, демонстрационный материал, животные.

0,5 % раствор химически чистого хлорида натрия, приготовленного на нейтральной бидистиллированной воде.

Сантинормальный раствор соляной кислоты.

Индикатор-1% водный раствор краски ализаринрот.

Петролейный эфир.

Рабочий стандартный раствор бихромата калия.

Вода дистиллированная

Пробирки

1. Сыворотка крови от различных животных

   Фотоэлектроколориметр

Всю используемую при анализах посуду для нейтрализации предварительно обрабатывают хромовой смесью.

VIII. Оценка работы студента преподавателем.

ЗАНЯТИЕ 22. Определение билирубина и общего белка

в сыворотке крови

Место проведения занятия-лаборатория кафедры.

Цель занятия-научиться определять в сыворотке крови билирубин, общий белок и давать клиническую оценку результатам исследования.

Текущий опрос студентов по следующим вопросам:

Значение исследования сыворотки крови на содержание в ней билирубина для дифференциации различных форм желтух.

Показатели общего белка сыворотки крови у здоровых животных и их изменения.

Объяснение методики выполнения работы преподавателем

Выполнение работы студентами.

Качественное определение билирубина в сыворотке крови

(по Ван-ден-Бергу)

Берут 2 маленькие пробки. В первую вносят 0,5 мл исследуемой сыворотки и добавляют 0,3 мл смеси диазореактивов; во вторую-0,5 сыворотки, 0,5 мл 96 0 спирта и 0,3 мл смеси диазореактивов (спирт во вторую пробирку добавляют для разрушения связи непрямого билирубина с глобулином крови).

Содержимое пробирки размешивают тонкой чистой палочкой. Розовое окрашивание в первой пробирке указывает на прямую, во второй пробирке-на непрямую реакцию.

Количественное определение (по Бокальчуку)

Для кратных разведений сыворотки берут 6 маленьких пробирок и наливают в каждую, за исключением первой, по 0,5 мл физиологического раствора поваренной соли, потом вносят по 0,5 мл исследуемой сыворотки в первую и вторую пробирки.

Сыворотку во второй пробирке тщательно смешивают с физиологическим раствором, после чего 0,5 мл смеси переносят в третью пробирку и также тщательно смешивают, 0,5 мл смеси из третьей пробирки переносят в четвёртую пробирку и т.д. Остаток (0,5 мл) из последней пробирки выливают в полоскательную чашку. В результате получают разведения:

№ пробирки 1 2 3 4 5 6

Степень разведения 1 2 4 8 16 32

Затем в каждую пробирку вносят по 0,5 мл абсолютного (или 96 град. спирта), встряхивают и получают взвесь белка в спиртовой вытяжке билирубина. В жидкость, помутневшую вследствие осаждения белка, наливают по 0,5 мл смеси диазореактивов, стеклянной палочкой осторожно перемешивают содержимое пробирок. В результате реакции сыворотка принимает розовое окрашивание. Концом реакции считают разведение, которое даёт едва различимое розовое окрашивание. Умножив степень разве

дения на 0,016, устанавливают количество билирубина в 1 мл сыворотки крови, а умножив её на 100--количество билирубина в миллиграмм % в 100 мл сыворотки. В первой пробирке это количество будет составлять 1,6 мг %, во второй-3,2, в третьей-6,4, в четвёртой-12,8, в пятой-25,6 и в шестой-51,2 мг %.

Определение билирубина в сыворотке крови (по Казакову)

Восемь чистых и сухих пробирок устанавливают в штативе. Затем в каждую пробирку вносят 0,5 мл исследуемой сыворотки и смешивают содержимое. Из этой пробирки при помощи пипетки набирают 0,5 мл смеси и переносят во вторую пробирку, из второй 0,5 мл жидкости переносят в третью и т.д. Из последней (восьмой) пробирки 0,5 мл смеси удаляют в сливательницу. Таким образом получают разведения сыворотки, кратные двум. Затем в каждую пробирку вносят по 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и тщательно встряхивают. После этого содержимое пробирок выливают в приготовленные заранее воронки из фильтровальной бумаги, на которых должны быть обозначения в соответствии с разведением крови. Воронки оставляют для высушивания при комнатной температуре. Учёт реакции производят на следующий день. Концом реакции считают разведения, при котором остаётся на фильтре хорошо различимое зелёное окрашивание.

Для расчёта можно пользоваться таблицей.

№ пробирки Степень разведения Количество билирубина

в 100 мл сыворотки

Определение общего белка в сыворотке крови

рефрактометрическим методом

Показатель преломления лучей света (рефракция) является характерной величиной для различных веществ. Существует зависимость между концентрацией вещества (в данном случае-белков) и степенью рефракции, что и используется для определения белков в сыворотке крови.

Для обогревания призм через резиновые трубки пропускают воду для установления постоянное температуры + 20 0 . Перед работой откидывают верхнюю часть измерительной головки. На поверхность измерительной призмы стеклянной палочкой наносят одну каплю исследуемой сыворотки и осторожно закрывают головку.

Наблюдая в окуляр зрительной трубы и вращая маховичок слева, находят границу раздела света и тени. Маховичком справа устраняют цветную кайму. Затем маховичком слева точно совмещают границу раздела с перекрестием сетки и снимают отсчёт по шкале показателей преломления. Расчёт содержания белка в исследуемой сыворотке ведут по специальной таблице.

Коэффициенты преломления сыворотки крови и соответствующие им количества общего белка.

Показатели общего белка в сыворотке крови у здоровых животных (г на 100 мл); у КРС –6-8,5; у овец-6-7,5; у свиней-6,5-8,5; у лошадей-6,5-7,8; у собак-5,9-7,6; у кур-4,3-5,9.

Результаты исследования.

Количество билирубина (мг %)

Количество общего белка (г %)

Заключение.

Учебное оборудование, демонстрационный материал, животные.

1. Реактивы:

сульфаниловая кислота-1г; соляная кислота (уд. вес 1,19) - 10 г;

дистиллированная вода-200,0;

азотистокислый натрий-0,5 г, дистиллированная вода-100мл.

Перед исследованием готовят смесь из расчёта на 10 мл 1-го реактива 0,3 или 0,6 мл 2-го реактива.

Пробирки.

Градуированные пипетки

1. Рефрактометр ИРФ-22

   Полоскательные чашки

   Глазные пипетки

   Спирт-эфир

   Сыворотка крови

   Физиологический раствор поваренной соли.

   96 0 спирт.

   20% раствор трихлоруксусной кислоты

   Фильтровальная бумага

VIII. Оценка работы студента преподавателем.